一 它像幽灵一般总是出现在菌体周围

二十世纪五六十年代，在可以观察到微观的纳米尺度的基础上，研究者们利用电子显微镜拍摄到了细菌的细胞壁结构，并对其进行了研究。现在，我们已明确的知道了细菌中革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的不同的细胞壁的组成（见下图）。

图1 革兰氏阴性菌和阳性菌的细胞壁结构

但在六十年代初，一位研究者在研究大肠杆菌的细胞壁结构时，发现了一个不能明确的解释的物质：他从拍摄到的大肠杆菌的电镜照片中观察到了突出的呈指状的结构，这些结构还可以与壁面分离形成液滴状游离体（图2中黑色粗箭头所示），他将之称为：幽灵- ghosts。这是早期对这种未知结构的描述。之后再观察到这些“幽灵”时，并没有吸引研究者们的眼球，科学家们想当然的以为它只是细胞用来排泄自身不需要的物质（如酶类、蛋白质等），无关紧要。但后来随着一些“好事之徒”进一步的研究了它的来源、内含物、去向，才开始一点点的解开它的面纱，发现这些“幽灵”很有可能是细胞派出的“得力干将”，让他们拿着自己的“手谕”向下游细胞或传达自己的信息，或呈递自己的物质（如蛋白质、核酸、脂类等），进而表达调控一些性状。

图2 大肠杆菌细胞壁结构及观察到的指状结构。

二 揭开幽灵的真实面目

这些“幽灵”最初在原核生物中发现，后来，在真核生物中也发现了他们的踪迹。横跨动物、植物、微生物三界，这“幽灵”可真够狂的。但由于不同生物来源的“幽灵”结构上有很大的不同，在对其进行研究时，也需要将这些结构按照来源进行分类，下面展示的是其中的一种分类方法。

图3 来源于革兰氏阴性菌和阳性菌的胞外囊泡。注：OMVs: outer- membrane vesicles 外膜囊泡；OIMVs: outer- inner membrane vesicles 内外膜囊泡；EOMVs: explosive outer- membrane vesicles 爆炸性外膜囊泡；CMV: cytoplasmic membrane 

vesicles 细胞质膜囊泡

图4 来源于哺乳动物的胞外囊泡。注：MVEs: multivesicular endosomes 多囊泡核内体；ILVs: intraluminal vesicles 管腔内囊泡

在20世纪70年代和80年代，像微颗粒（microparticles）、微囊泡（microvesicles）、膜碎片（membrane fragments）和膜囊泡（membrane vesicles）等术语开始被用来描述培养的肿瘤和非肿瘤细胞系产生的囊泡，或在生物液体中获得的囊泡。在这些文章中，这些“幽灵”被证明具有促凝或酶活性，并认为是从细胞的质膜脱落而来。1983-1985年，Stahl和Johnstone的研究小组证明细胞分泌的膜囊泡通过内吞作用、核内体内腔内囊泡(ILVs)的形成和多泡核内体(MVE)与质膜融合的三步过程，导致ILVs的释放即胞外囊泡。网织红细胞被证明可以分泌这种胞外囊泡是用来消除不必要的跨膜蛋白。

接下来我重点介绍胞外囊泡中研究较多的一个亚种：Exosome外泌体。

术语“外泌体”在1987年被提出，指的是由哺乳动物细胞分泌的胞外囊泡。1996年由Raposo等人证实外泌体能够作为一种细胞间通讯结构在免疫系统中发挥作用后得到了广泛关注。在20世纪90年代末，两个研究免疫系统抗原提呈细胞的小组表明外泌体也携带能在靶细胞中诱导信号传递的表面分子，因此它们不仅是“垃圾桶”，而且还是细胞间的通信设备。2013年，发现“细胞囊泡运输调控机制”的科学家荣获了诺贝尔生理学或医学奖，这一重大发现也开启了外泌体研究的热潮。2015年Melo等发现，外泌体Glypican-1蛋白可有效区分慢性胰腺炎与胰腺癌以来,外泌体作为疾病诊断、预后预测标志物以及药物靶向治疗载体的转化医学应用也得到了迅速的推进。

外泌体可以由体内或体外培养的几乎所有类型的细胞分泌，并广泛存在于血浆、胆汁、尿液、母乳、唾液、胸腔积液、淋巴、胃酸、支气管肺泡灌洗液、脑脊液、眼泪、精液、滑膜液、羊水、腹水、鼻分泌物和子宫抽吸物液体等体液中。外泌体具有独特的理化性质,其密度为1.13~1.19 g/mL，由平均厚度小于5 nm的双层脂膜所包裹,具有典型杯状形态，呈现为扁平球形。外泌体可携带蛋白质、核酸和脂质等生物活性大分子，其中主要为蛋白质，且大部分蛋白为所有来源外泌体所共有，只有小部分与其来源有关，为其分泌细胞的特有蛋白，能够反映分泌细胞的类型和生理病理状态。外泌体是细胞间信息传递的重要“信使”，可通过三种方式介导细胞通讯：(1)外泌体以旁分泌的方式与靶细胞相互作用，通过受体–配体作用黏附到靶细胞表面，随后被内吞入靶细胞，或直接将内容物释放到靶细胞内，从而激活靶细胞；(2)外泌体的胞外膜蛋白可以被蛋白酶切割，产生的片段可以与靶细胞的细胞表面受体结合，从而激活靶细胞；(3)外泌体还可以与靶细胞直接接触发生膜融合，导致外泌体中的蛋白和核酸非选择性转移到目标细胞，从而引起靶细胞的响应。

图5 外泌体结构及人体外泌体产生的部位示意图

我们之前所了解到的细胞与细胞之间的通讯方式，其中的一种是直接释放小分子物质。举了例子，2016年里约奥运会100 m仰泳铜牌得主傅园慧在接受采访时，回答记者提问时用了“洪荒之力”四个字，其实是身体在接受到游泳比赛的信号时，刺激下丘脑释放促肾上腺素释放激素，作用于肾上腺髓质，此时，肾上腺髓质释放肾上腺素，这种物质能够作用于身体的很多部位，使得机体的血流量增大、血糖量升高、量增强、反应速度提高等。类似的这些小分子物质通过血液进行远距离运输达到作用靶点，但当机体不友好，有了能够降解这些小分子的酶等其他物质时，可就成了这些小分子的拦路虎。而囊泡具有脂质双分子层结构，有降解作用的酶等物质对这种结构无可奈何，所以从这个层面上来说，囊泡很大程度上提高了细胞间的通讯、物质传递等的效率。那么，我们又可以如何利用这个优势，将囊泡为我所用呢？

三 将“幽灵”招入麾下，为我所用

外泌体由于荷载着许多蛋白，核酸和脂质，这些物质在来源、去向以及它们作用的靶点和作用的结果都能代表了很多的信息，另外囊泡的脂质双分子层结构很好的保护了内部包含的物质不被降解，因此，挖掘这些信息、利用它的结构，有望我们从另一方面了解甚至是改造生物。

3.1 递送药物

从小分子到核酸再到蛋白质，药物的设计和效力在过去几十年中不断取得进展。但一个关键问题仍然有待解决：如何才能最有效地将它们运送到靶细胞？传统的给药方式包括合成脂质纳米颗粒和病毒载体，目前它们分别被用于BioNTech/Pfizer和Oxford/Astrazeneca的COVID-19疫苗，以及许多蛋白质、RNA和基因疗法。但是这两种方法都有局限性，包括它们能到达的身体区域，能到达的组织内细胞数量，以及避免触发有害免疫应答的能力。

研究者发现外泌体具有与当前用作药物递送系统的纳米颗粒相似的特性，比如稳定性、通透性、免疫原性较低、毒性较低、生物相容性高、高的可工程操作性、低清除率和适合细胞靶向传递的特性等，使得近几年来外泌体在辅助给药方面得到了极大的关注。外泌体已经被证明可以渗透到组织中，扩散到血液中，甚至穿越血脑屏障。此外，它们也可以迁移到没有血液供应的组织或区域，例如致密的软骨基质。作为天然存在的纳米粒子，外泌体可避免免疫识别。与基因疗法相比较，利用外泌体递送药物，不仅可以重复给药，而且可以在第一时间到达更多的细胞。外泌体除了增强分子的组织渗透性并因此减少总体全身暴露外，还有希望提高靶向的精确度。

图6 外泌体作为载体进行封装和将基因载体递送至靶细胞的过程。

简单的来说将起治疗疾病的药物或小分子包裹在外泌体的双层脂质膜内，双层脂质膜可以保护药物在递送过程中被降解，由于选择的具有特定靶向目的细胞的外泌体，所以这些外泌体可以将起治疗疾病的药物或小分子送至靶细胞，从而起治疗疾病的作用。

将外泌体技术用于新冠肺炎的治疗也引起了一定的关注。2020年8月，临床阶段生物技术公司Kimera？Labs Inc宣布已提交扩展的FDA研究新药（IND）申请，以研究使用Kimera的新药产品XoGlo？治疗COVID-19相关炎性疾病。XoGlo？是胎盘间充质干细胞的外泌体。而InnoCan Pharma与特拉维夫大学技术转让处Ramot签订了一项的研究协议，与Ramot合作开发一种新颖的、革命性的方法，使用负载了大麻二酚（CBD）的外泌体（CLX）治疗新冠病毒COVID-19。

3.2 疾病筛查

“龙生龙，凤生凤，老鼠的儿子会打洞。”正常的细胞会产生正常的外泌体，病变的细胞会产生病变的外泌体。当我们发现一些组织或细胞的外泌体的结构、组份或者内含物发生变化时，我们就需要更多的关注这个组织或者细胞了，因为它可能已经发生了生病了。而研究结果发现事实也是如此：一些肿瘤细胞产生的外泌体果然是与众不同的。而将这些“与众不同”作为疾病筛选的标志物在一定程度上提高了疾病筛查的准确率和效率。早期癌症诊断和特定的肿瘤示踪剂是癌症治疗中的最大挑战之一，迅速发展的外泌体技术提供了强大的功能整合诊断和治疗的工具。

3.3 外泌体的其他作用及其产业化

除了递送药物和疾病筛查的用处外，外泌体还有很多的天赋，比如用于再生修复、伤口愈合、参与机体免疫调节、抗炎特性等，无不彰显着“小小的身体蕴含着巨大的能量”，好像我们不利用它会埋没它的才能，于是选择外泌体作为药物载体的想法已受到制药公司的深度关注。多家制药公司正在押注外泌体和其他细胞外囊泡作为核酸药物递送的一种手段。一系列大型制药公司的交易表明，该行业正在拥抱外泌体，以将核酸药物递送至难以到达的组织。仅在6月，礼来、武田和拜耳就宣布了外泌体公司相关的超过10亿美元的交易（表1）。此外，近年来，一些新兴公司如雨后春笋般涌现，专注于开发治疗性外泌体或其他细胞外囊泡（EVs）作为基因和RNA药物的递送载体，因为它们是天然的核酸载体。

表1 外泌体投资情况

四. 未来设想（若囊泡的发生是由基因控制，可否像选择的基因工程一样，基因编辑囊泡）

现代分子生物学技术的发展想必大家有所耳闻，像克隆羊多莉、基因编辑猴、试管婴儿等等，在伦理道德允许的范围内，基因编辑像“上帝之手”一样改变了我们传统的对生命的认识。外泌体来源于细胞，这个来源手否是由基因调控的呢？如果是，那么已经应用于基因工程的成熟的基因编辑手段是否可以直接应用于外泌体工程中，产生我们想要的外泌体，应用于我们想要用的用途中。通过基因工程和化学方法对外泌体进行工程化改造以实现药物靶向递送。外泌体治疗的未来包括靶向外泌体与抗癌药和高精度癌症诊断探针的组合，以构建用于体内追踪、预后监测和治疗的多功能平台。

看到这里，你是否也想利用外泌体包裹或携带一些物质来达到你想达到的目的呢？请尽情想象！

面对科学研究中出现的“幽灵”，是敬而远之？是想当然？是接近它然后实现它？我想，可以从囊泡、外泌体的发现和利用的过程中得到一些启发。有时候，想当然中存在着我们看不到的真理。

参考文献：

[1] Masanori, Toyofuku, Nobuhiko, et al. Types and origins of bacterial membrane vesicles.[J]. Nature Reviews Microbiology, 2018.

[2] 韩杰,葛安,马晓霞,王佳月,杨彩婷,董丽.外泌体提取及保存技术研究进展[J].中国细胞生物学学报,2021,43(02):451-459.

[3] Bayer M E , Anderson T F . The surface structure of Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1965.

[4] Niel G V , D'Angelo G , Raposo G . Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2018.