一、概述

基因工程制药是利用现代生物技术手段，通过改造生物体的遗传物质来生产药用蛋白或多肽的一类制药技术。

基因工程药物就是先确定对某种疾病有预防和治疗作用的蛋白质，然后将控制该蛋白质合成过程的基因取出来，经过一系列基因操作，最后将该基因放入可以大量生产的受体细胞中去（包括细菌、酵母菌、动物或动物细胞、植物或植物细胞），在受体细胞不断繁殖，大规模产具有预防和治疗这些疾病的蛋白质。

图表1：基因工程制药主要步骤

二、基本原理

1.中心法则应用 

（1）‌遗传信息传递机制解析基于DNA→RNA→蛋白质的遗传信息流动原理，通过外源基因的表达来生产目标蛋白药物。

（2）‌疾病研究与治疗‌

① ‌病毒学研究‌：RNA病毒（如HIV）通过逆转录酶将RNA逆转录为DNA，整合到宿主基因组中，这一过程是抗逆转录病毒药物的靶点。‌

② ‌基因疗法‌：通过载体将正常基因导入患者细胞，利用中心法则的转录翻译机制补偿缺陷基因功能‌

（3）‌生物技术应用‌

① ‌基因工程‌：通过体外重组DNA技术，将外源基因导入宿主细胞，利用宿主细胞的转录翻译系统生产目标蛋白（如胰岛素）‌。

② ‌RNA干扰技术‌：利用小RNA分子特异性降解目标mRNA，阻断基因表达，用于功能基因组学研究及疾病治疗‌。

（4）‌进化与物种多样性研究‌

2.分子克隆技术 ：分子克隆技术是分子生物学中的核心技术之一，其核心原理是通过体外重组将目标基因与载体结合，经宿主细胞扩增后实现特定DNA序列的大规模复制。

图表2：分子克隆主要步骤

3.蛋白质合成机制 ：利用宿主细胞的转录翻译系统合成外源蛋白。

（1）转录阶段

① ‌DNA模板解旋‌：RNA聚合酶结合启动子区域，解开DNA双链，以其中一条链为模板合成mRNA前体‌。

② ‌mRNA加工‌：前体需剪接去除内含子，并在5'端添加帽子结构、3'端添加多聚腺苷酸尾，形成成熟mRNA‌。

（2）翻译阶段

① ‌起始阶段‌

核糖体小亚基识别mRNA的5'端帽子结构和起始密码子AUG，携带甲硫氨酸的起始tRNA与之结合，随后大亚基组装形成翻译起始复合物‌。

② ‌延长阶段‌

氨酰tRNA依次进入核糖体A位，肽酰转移酶催化肽键形成，核糖体沿mRNA从5'→3'方向移动，每延伸一个氨基酸消耗4个高能磷酸键‌。

③ ‌终止阶段‌

遇到终止密码子（UAA/UAG/UGA）时，释放因子促使新生肽链释放，核糖体解离。‌

（3）翻译后修饰

新生肽链需经折叠、二硫键形成、糖基化等修饰，原核生物在细胞质完成，真核生物则依赖内质网和高尔基体协作加工。‌

（4）调控机制

① ‌转录调控‌：通过转录因子和DNA甲基化等表观遗传修饰实现‌。

② ‌翻译调控‌：miRNA可抑制mRNA稳定性或翻译效率，泛素蛋白酶体系统降解错误折叠蛋白‌。

该过程通过遗传密码的方向性、连续性及简并性特性，确保翻译的高效性与准确性‌。

图片3：蛋白质合成

三、关键技术

1. 目的基因获取

（1）化学合成法 

基因制药中的化学合成法是一种广泛应用于短链DNA合成的技术，其核心原理是通过固相亚磷酰胺法逐步构建核苷酸链。

① ‌基础原理‌

第一、‌固相合成‌：将首个核苷酸的3'-OH端通过烷基臂固定在固相载体（如硅胶珠）上，5'-OH端用二甲氧基三苯甲基（DMT）保护‌。

第二、‌循环反应‌：每个合成循环包含四个步骤。

a.‌去保护‌：用酸性溶液去除DMT基团，暴露5'-OH以便后续反应。

B.‌偶联‌：加入经四唑激活的核苷酸单体，与5'-OH形成磷酸二酯键。

C.‌加帽‌：乙酰化未反应的5'-OH，防止错误延伸。

D.‌氧化‌：将亚磷酸三酯氧化为稳定的磷酸三酯结构‌。

② ‌技术特点

第一、‌‌长度限制‌：通常适用于200bp以下的寡核苷酸合成，超过此长度需依赖酶促法或其他组装技术‌。

第二、‌自动化程度高‌：支持高通量合成，但复杂结构（如双价siRNA）可能面临纯度低、产率低等问题‌。

第三、‌化学修饰兼容性‌：可引入硫代磷酸酯（PS）等修饰，但exNA等特殊修饰会增加合成难度‌。

（2）cDNA文库筛选 ：

cDNA文库筛选是基因制药中的关键技术，其原理涉及从特定细胞中提取mRNA并构建代表该细胞转录组的cDNA克隆库。

① ‌文库构建基础‌

第一、‌mRNA来源‌：从目标组织或细胞中提取总RNA，通过oligo(dT)磁珠富集poly(A)+ mRNA‌。

第二、‌反转录过程‌：使用逆转录酶将mRNA转化为单链cDNA，再通过DNA聚合酶合成双链cDNA‌。

第三、‌载体连接‌：双链cDNA与质粒/噬菌体载体连接，形成重组DNA分子并导入宿主菌群‌。

② ‌文库质量关键指标‌

第一、‌代表性‌：文库需覆盖细胞中全部表达的mRNA种类，人类细胞文库通常需≥10‌6克隆（99%概率包含所有转录本）‌。

第二、‌完整性‌：包含5'非编码区、编码区和3'非翻译区，确保基因功能研究需求‌。

第三、‌载体选择‌：噬菌体载体适合全长cDNA克隆（装载容量大），质粒载体则便于高通量筛选‌。

③ ‌筛选技术原理‌

第一、‌杂交法‌：使用放射性或荧光标记的探针（如cDNA探针）与文库克隆杂交，特异性结合目标基因‌。

第二、‌PCR扩增‌：针对已知序列设计引物，通过PCR从文库中扩增目标基因‌。

第三、‌表达筛选‌：若目标产物为蛋白质，可通过抗体检测表达产物（如ELISA）筛选阳性克隆‌。

（3）PCR扩增 ：

PCR扩增是基因制药中用于特异性扩增DNA片段的核心技术，其原理基于DNA半保留复制特性，通过循环变性、退火和延伸三步反应实现目标基因的指数级扩增。

① ‌扩增循环原理‌

第一、‌变性（94-98℃）‌：高温使双链DNA解旋为单链模板‌。

第二、‌退火（50-65℃）‌：引物与单链DNA特异性结合，退火温度需低于引物熔解温度（Tm值）3-5℃‌。

第三、‌延伸（72℃）‌：Taq DNA聚合酶以dNTPs为原料，沿5'→3'方向合成新链‌。

② ‌关键组分‌

第一、‌Taq酶‌：耐高温DNA聚合酶，避免每轮循环重新添加‌。

第二、‌特异性引物‌：20-30碱基的寡核苷酸片段，决定扩增目标区域‌。

第三、‌dNTPs与缓冲液‌：提供合成原料并维持反应环境（如Mg²⁺）‌。

‌（4）基因编辑技术 ：

基因编辑技术在基因制药中的应用基于对DNA序列的精确修改，目前最成熟的技术是‌CRISPR-Cas9系统‌。

CRISPR-Cas9技术原理‌

‌RNA引导切割‌：通过设计的单导向RNA（sgRNA）识别目标DNA序列，并将Cas9酶引导至特定位置‌。

第一、‌DNA双链断裂‌：Cas9酶像分子剪刀一样切割目标DNA，产生双链断裂（DSB）‌。

第二、‌细胞修复机制‌：

A.‌易错修复（NHEJ）‌：导致随机插入或缺失，使基因功能失活‌。

B.‌精准修复（HDR）‌：需提供模板DNA，实现特定序列的插入或替换‌。

图片4：目的基因的获得方法

2. 表达载体构建

（1）常用载体：

基因制药中常用的载体主要包括质粒、噬菌体和病毒载体。

①‌质粒载体‌

第一、‌结构特性‌：小型环状DNA分子，独立于宿主染色体，含复制原点（Ori）、多克隆位点（MCS）和标记基因（如抗生素抗性基因）‌。

第二、‌工作原理‌：通过限制性内切酶切割质粒DNA，插入目的基因后导入宿主细胞，利用复制原点实现自我复制‌。

② ‌病毒载体‌

第一、‌常见类型‌：腺病毒、慢病毒、逆转录病毒等，通过感染机制将外源基因整合至宿主基因组‌。

第二、‌设计关键‌：去除病毒致病基因，保留感染和整合功能，携带治疗性基因序列‌。

③ ‌噬菌体载体‌

第一、‌特性‌：以λ噬菌体为代表，可包装长片段DNA（~50kb），通过感染细菌实现基因扩增‌。

第二、‌操作要点‌：需构建噬菌体基因组与目的基因的重组体，利用噬菌体包装蛋白体外组装感染颗粒‌。

（2）必需元件

基因制药中的必需元件主要包括载体系统、调控元件及宿主细胞表达系统。

① ‌载体系统‌

第一、‌质粒载体‌：含复制原点（Ori）、多克隆位点（MCS）和标记基因（如抗生素抗性基因），通过限制性内切酶切割和连接酶重组，实现外源基因的克隆与扩增‌。

第二、‌病毒载体‌：如腺病毒或慢病毒，通过改造去除致病基因并携带治疗性基因，利用天然感染机制实现高效转导‌。

第三、‌噬菌体载体‌：适合大片段DNA（如λ噬菌体，~50kb），通过体外包装感染宿主细胞‌。

② ‌调控元件‌

第一、‌启动子‌：位于基因上游，招募RNA聚合酶启动转录，其序列决定表达强度和特异性‌。

第二、‌终止子‌：标记转录终点，确保RNA分子完整性‌。

第三、‌增强子/沉默子‌：远距离调控基因表达，通过DNA环化与启动子相互作用‌。

③ ‌宿主细胞表达系统‌

第一、‌原核系统（如大肠杆菌）‌：成本低、生长快，但缺乏真核修饰功能‌。

第二、‌真核系统（如CHO细胞）‌：可进行糖基化等修饰，适合复杂蛋白药物‌。

第三、‌工程菌优化‌：通过控制碳源、补料速率等减少代谢副产物（如乙酸）对表达的抑制‌。

（3）启动子

① CMV

CMV启动子源自人巨细胞病毒基因组，具有强效转录活性，可显著提升外源基因在哺乳动物细胞中的表达效率。其增强子区域含多个转录因子结合位点，通过激活宿主细胞转录机制实现高效基因表达。‌

② lac

基因制药中Lac（乳糖操纵子）的应用主要基于其作为原核生物基因表达调控的经典模型。Lac操纵子的结构组成。

A.‌结构基因群‌

第一、‌lacZ‌：编码β-半乳糖苷酶，催化乳糖分解为葡萄糖和半乳糖‌。

第二、‌lacY‌：编码乳糖通透酶，促进乳糖跨膜运输‌。

第三、‌lacA‌：编码转乙酰基酶，参与乳糖代谢副反应‌。

B.‌调控元件‌

第一、‌启动子（P）‌：RNA聚合酶结合位点。

第二、‌操纵基因（O）‌：阻遏蛋白结合位点。

第三、‌调节基因（I）‌：编码阻遏蛋白，通过负调控抑制转录。‌

③ T7

第一、‌T7 RNA聚合酶‌

具有高度启动子特异性，仅识别T7启动子序列‌。转录效率是大肠杆菌RNA聚合酶的5倍，可实现超高表达‌。

第二、‌T7启动子‌

序列为TAATACGACTCACTATAGGG，为强启动子‌与T7 RNA聚合酶形成专一性转录复合物‌。

（4）筛选标记(抗生素抗性基因)通过载体携带的抗生素抗性基因（如氨苄青霉素抗性基因ampr）使成功转化的细胞在含抗生素培养基中存活，未转化细胞被淘汰。‌

（5）复制起点

复制起点是DNA分子上启动复制的特定序列，包含识别和结合复制蛋白的保守区域，确保载体在宿主细胞内的稳定扩增‌。

（6）克隆位点

克隆位点是载体DNA上专为外源基因插入设计的特定序列区域，通常包含多个限制性内切酶识别位点，构成多克隆位点（MCS）‌12。其核心作用是为目的基因提供定向插入的接口。

图片5：基因表达载体构建

3.宿主系统选择

需根据目标蛋白特性（如翻译后修饰需求、分子量、溶解性）选择宿主系统，例如：需糖基化修饰的蛋白应选用哺乳动物细胞（如CHO细胞）‌原核蛋白表达首选大肠杆菌系统。‌

（1）原核表达系统 （大肠杆菌）：

通过质粒将外源基因（如胰岛素基因）导入大肠杆菌，利用其高效表达系统进行蛋白合成‌。质粒作为运载体，可在宿主细胞内自我复制并携带目标基因‌。典型载体包含复制起点（ori）、多克隆位点（MCS）及筛选标记。‌

第一、优点：成本低、周期短、产量高。

第二、缺点：缺乏翻译后修饰。

第三、代表产品：

a.胰岛素

胰岛素是由胰脏内的胰岛β细胞分泌的一种蛋白质激素，是机体内唯一具有降血糖功能的激素，同时参与调节糖原、脂肪和蛋白质的合成代谢‌12。其核心作用机制是通过与细胞表面受体结合，促进葡萄糖摄取利用，抑制肝糖原分解及糖异生，从而维持血糖平衡‌。

b人生长激素

（2）真核表达系统 ：

外源基因通过载体导入真核细胞（如CHO细胞、HEK293细胞）后，在宿主细胞的核糖体上完成翻译过程，生成具有天然构象的蛋白质。

① 酵母系统：有基础糖基化，如毕赤酵母。

② 昆虫细胞：杆状病毒表达系统。

③ 哺乳动物细胞(CHO、HEK293)。

代表产品：单克隆抗体、EPO。

图片6： 基因制药宿主系统选择

4. 转染与筛选

通过物理/化学方法将外源DNA/RNA导入宿主细胞质，依赖电荷相互作用形成复合物穿过细胞膜。真核细胞需通过有丝分裂期核膜融合实现基因入核。‌

（1）转染方法：

① 电穿孔

通过瞬时高压电脉冲（通常200-1000V/cm）使细胞膜磷脂双分子层发生重排，形成瞬时亲水性微孔（直径约1-2nm），外源DNA/RNA通过电泳作用进入细胞内部。‌‌

② 脂质体

由磷脂两性分子（亲水头部+疏水尾部）自发组装形成中空囊泡结构，内层疏水区可包载脂溶性药物，亲水内核容纳水溶性活性成分‌。通过添加胆固醇（增强稳定性）、可电离脂质（如DLin-MC3-DMA）或靶向配体（如抗体片段）实现性能优化。‌

③ 病毒转导

（2）稳定转染细胞株筛选：

抗生素加压筛选：载体携带的抗生素抗性基因（如氨苄青霉素抗性基因Ampᵣ）编码特定酶，可分解对应抗生素或修饰其作用靶点，使成功转化的细胞在含药培养基中存活。

图表7：基因制药-转染与筛选

5. 蛋白纯化技术

（1）亲和层析(镍柱、Protein A/G等)

亲和层析（Affinity Chromatography）是一种基于生物分子间特异性相互作用的层析技术，通过固定化配体选择性捕获目标分子实现高效分离纯化‌。

图表8：亲和层析

（2）离子交换层析

离子交换层析（Ion Exchange Chromatography, IEC）是一种基于物质表面电荷差异进行分离的色谱技术，广泛应用于生物大分子（如蛋白质、核酸）的纯化。

图表9：离子交换层析

（3）分子筛层析

分子筛层析（Molecular Sieve Chromatography）是一种基于分子尺寸差异进行分离的层析技术，其核心原理是利用多孔凝胶填料的筛分效应实现物质分离。

图片10:分子筛层析

（4）疏水相互作用层析

疏水相互作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC）是一种基于生物大分子表面疏水性差异进行分离的层析技术，广泛应用于蛋白质、多肽等生物大分子的纯化‌。

图片11：疏水相互作用层析

基因工程制药技术现已发展成为生物医药产业的核心支柱，随着合成生物学、人工智能等技术的融合，其应用范围和效率将持续扩展提升。

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