对人类基因的测序可以帮助我们更好地了解疾病成因、人类遗传和个体化基因，在疾病诊断治疗和个性化医疗方面具有相当重要的生物医学意义。基因测序在识别与复杂人类疾病有关的遗传风险因素上发挥着至关重要的作用。运用基因信息可研究遗传与人的健康与疾病的关系，为各种遗传病的诊断、治疗及新药开发提供了分子基础。例如，全基因组测序结果可用于追根溯源到单个肿瘤细胞，并可继而进行基因层次的介入、干预、治疗。通过比较癌变细胞和正常细胞基因表达差异，将能很快的确定治病机理，提供治疗所必需的信息。在新药开发方面，生物信息学工具和数据库可用于鉴定新基因，寻找药物作用的靶位点。因此，对DNA进行测序研究，对于多种目前我国发病率极高的几种疾病（如恶性肿瘤、心血管疾病、糖尿病等多基因疾病）的诊断和新药的研发具有举足轻重的意义，为经济社会和谐快速发展发挥重大作用。

2004年美国国家卫生局提出的第三代基因测序-1000美元基因测序计划，旨在24小时内用1000美元以下成本对人体基因进行快速测序，降低现有的人类基因测序成本。这将引发生命科学和医疗等领域一场革命性变革。2009年，美国国立卫生研究院人类基因研究所（NHGRI）拨款1900万美元来支持这一计划, 更是极大的引发了该领域的研究热潮。新一代DNA测序技术是近十年来生物医学领域中发展最快、竞争最为激烈、影响最大、也是产业化最快的高技术领域之一。

基于纳米孔传感器的DNA测序技术由于无需标定、无需扩增、使用剂量少、可读长序列、低成本、可实现单分子高通量探测等诸多优势，成为第三代基因测序领域中研究最为活跃和有潜力的竞争者之一。除此之外，固态纳米孔生物传感器在单分子探测及某些早期疾病诊断领域也将发挥独特作用。

纳米孔测序的原理比较简单（图1）：纳米孔是在绝缘薄膜上溅射加工出的一个尺度为几纳米的孔，薄膜将电泳池两端的电解液实现有效隔离，当溶液中的带电分子在电场驱动下电泳通过此纳米孔时，就会对通过纳米孔的离子电流信号进行相应调制。由于DNA分子链的断面尺度为1-2 nm, 可以在电场驱动下通过纳米孔，而构成DNA的四种碱基A, C, T, G对电流信号的调制有所不同，对此电流信号的读取即可得到对应DNA分子的碱基序列信息，从而实现对长链DNA分子的实时快速序列测定。利用该技术可以直接对数千碱基对长度的单链DNA 分子进行表征，避免了扩增或标记实验准备环节，使得快速低成本DNA测序技术成为可能。

图1. 纳米孔生物传感器单分子探测示意图；测序原理图；离子电流基线和DNA分子通过时电流示意图

对于利用纳米孔器件对生物分子探测（DNA测序）的尝试最初可以追溯到1996年.人们发现利用尺度在1.5 nm的a溶血素（生物纳米孔,图2）可以对DNA的碱基进行探测。但是生物纳米孔的力学稳定性不佳，对实验条件要求非常苛刻，不利于大规模集成等缺点限制了其它的发展。2001年，人们利用氮化硅（SiN）纳米孔（固态纳米孔，图2）实现了对DNA分子的穿孔信号探测。固态纳米孔相比于生物膜有很多优势，比如：纳米孔径和孔深灵活可调，对于温度、溶液pH值和生理环境稳定，纳米孔表面性质可调节性，与器件阵列等可兼容，等等。

目前，此领域中遇到的最大挑战和困难是：1）DNA分子在电场作用下通过纳米孔的速度过快，100 mV下可达到每微秒几十个核苷酸，远大于现有仪器的信号采集频率, 超过了仪器的最高分辨率；2）纳米孔所在的支撑膜厚度太厚（大于10纳米，即20‐30个碱基对的长度），导致DNA穿孔时，通过纳米孔中的是多个碱基之和，难以实现单碱基分辨。以上两个问题可归结为时间分辨率和空间分辨率（图2），也是目前纳米孔DNA测序领域中所需要面对和解决的最重要的两个关键问题。

Spatial resolution                   Time resolution

图2. 生物纳米孔和固态纳米孔示意图；纳米孔DNA测序的两大挑战

北京大学物理学院纳米孔传感器课题组自2009年开始就领域内的难点展开研究，利用一套自上而下跨尺度集成制造固态纳米孔传感器的方法，利用光刻、湿法腐蚀、聚焦离子束刻蚀、聚焦电子束轰击等加工方法从一个4英寸硅片可成功批量制备500-600个3mm见方的氮化硅纳米孔传感器芯片（图3a,b）。利用透射电子显微镜中的高能聚焦电子束（300 kV高压），通过调节束斑大小和辐照时间，成功实现了尺寸精确可调的纳米孔器件，最小孔径可达2 nm，最高控制精度高达1 nm（图3c）。此外，还利用移动会聚电子束在纳米孔的不同位置，实现了对纳米孔器件几何构型的调制。

图3. a: 经过微纳加工后的部分4英寸硅片照片，上含有几百个纳米孔传感器芯片。b：单个3mm见方纳米孔芯片SEM照片图。c: 几种不同尺寸的纳米孔高分辨TEM图。纳米孔尺寸大小精确可调，精度高达1 nm。

国际上通常采用的氮化硅纳米孔膜空间分辨率较低，针对这一难题，课题组在国际上首次提出并实现了利用超薄氮化硼（BN）纳米孔对DNA分子进行超高灵敏度单分子检测，达到了目前纳米孔单分子检测的最高空间分辨率，成为非常有希望实现第三代DNA测序的关键材料。用我们自主发展的精确转移二维超薄材料的方法和精确可控加工纳米孔传感器的技术，课题组成功制备出厚度仅为1.1 nm的氮化硼纳米孔器件（图4），与DNA的单碱基厚度可比拟，极大提高了空间分辨率，探测灵敏度比传统氮化硅纳米孔器件提高5倍以上。

图4.  左：氮化硼纳米孔探测DNA器件示意图。中：氮化硼悬空膜和纳米孔TEM图。右：纳米孔孔径和孔长（膜厚）变化依赖关系图。

除了空间分辨率之外，目前国际上困扰固态纳米孔传感器无法完成测序的另一瓶颈是DNA单分子穿孔速度太快，因而时间分辨率低。例如，利用固态纳米孔的DNA单分子穿孔速度为每毫秒1000个碱基对，远远超过了仪器探测分辨率，无法识别单碱基。针对这一难题，课题组提出了将压强引入到纳米孔中，实现将驱动力和信号读取彻底分离的新方法，有效将探测时间分辨率提高了1-3个数量级（图5），并且保持了很高的测量信噪比和捕获率，为应用于测序迈进了重要一步。

由于压强引入完全不依赖于电场，我们利用纳米孔传感器首次成功实现了对近中性分子（例如：PEG）的单分子探测，大大扩展了可探测分子范围。此外，由于时间分辨率的大幅提高，可实现对之前由于穿孔速度过快而导致无法探测到的短链分子（<620 碱基对）的有效探测。并且在固态纳米孔中首次实现了对不同长度DNA分子（长度差仅为600个碱基对）的有效区分，大幅拓展了探测链长，扩展了固态纳米孔的单分子探测能力和基于纳米孔技术的其他相关应用。

图5. 上: 纳米孔器件单独施加电场，和压强和电场双场耦合后DNA受力模拟计算图。下: 单独施加电场（a），压强和电场双场作用（b）下的DNA穿孔事件散点分布图。

固态纳米孔生物传感器除了在DNA测序方面展现的巨大应用潜力之外，作为一个单分子探测平台，可以用于某些与疾病相关的蛋白检测以及其他在生物领域内有意义的单分子探测过程，具备持续研究的生命力和研究意义。