[摘要]  近年来，癌症的发病率和死亡率持续上升^[1]。并且相关报道表明，虫草素可以抑制癌症的发生，因为我们对肝癌比较感兴趣，因此我们检测了带有虫草素的泰山虫草对肝癌的影响。探究其对肝癌细胞的迁移和增殖是否有抑制作用，寻找泰山虫草的功效，探寻预防、检测及治疗癌症的方法。本文运用MTT技术^[2]、划痕实验^[3]以及western blot检测多个迁移蛋白marker表达量来进行研究。我们发现，泰山虫草能够抑制肝癌细胞系的增殖和迁移。对于其抑制机制我们还在探究。

[关键词]  肝癌， 泰山虫草，迁移， 增殖

1.  目的意义

现癌症发病率和死亡率越来越高，癌症化疗引起的并发症也难以解决^[4]，癌症的防治已成为一个全球性的问题^[5]。为了生存和发展，人类必须攻克癌症。目前为止，仍然没有一个好的治疗癌症的方法，癌症问题亟待解决。我们查资料得知虫草具有抗肿瘤、抑菌、抑制病毒、抑制蛋白质激酶活性等作用^[6]。随着当今社会经济的飞速发展，生活水平不断提高，人们对“营养、保健、安全”食品的要求与日俱增，以药用真菌为主要原料的保健与医药产品^[7]，恰是满足了人们的这种渴求而身价倍增，成为食用菌产业发展的一个亮点。

中科院上海植物生理生态研究所王成树课题组在国际著名杂志《细胞》的子刊《Cell Chemical Biology》发表最新研究成果，证实冬虫夏草中不含有“喷司他丁”和“虫草素” ^[8]，而这两种成分被认为具有一定的抗癌功效。然而泰山虫草中却含有“虫草素”^[9]，但是泰山虫草是否有抗癌作用现在仍然是未知的^[10]。肿瘤的发生需要经过细胞的异常增殖和迁移^[11]，如果泰山虫草可以制止这两个特点的发生，那么将会对癌症的治疗做出巨大的贡献。近年来肝癌发病率越来越高^{[12] [13]}，因此，我们检测了泰山虫草对肝癌发生的影响，探究其对肝癌细胞的迁移和增殖是否有影响，通过哪种成分发挥作用，进一步探究泰山虫草的功效，寻找预防治疗癌症的方法。

前人研究得出：虫草素抑制肿瘤细胞生长^[14]，柞蚕蛹虫草水提物(AEoAPC) 对人肝癌SMMC-7721细胞有抑制增殖和诱导凋亡的作用^[15]，虫草素通过对肿瘤细胞RNA的抑制表现出抗肿瘤作用^[16]，蛹虫草汤剂通过诱导H22肿瘤细胞凋亡和增强肿瘤小鼠免疫力进行体内抗肿瘤抑制作用^{[17] [18]}。然而泰山虫草是否只通过虫草素和喷死他丁抑制癌细胞增殖和迁移呢？是否还有其他成分参与其中呢^{[19] [20]}？同时，关于虫草素抑制癌症的机制也不清楚。再者，人们对于泰山虫草对癌细胞迁移的影响的研究少之又少，泰山虫草对癌症的作用还有很大的研究空间^[21]。

2.  我们的思路

    我们利用设置不同泰山虫草提取液的加药量来分别处理两种肝癌细胞系huh7细胞和7721细胞，观察泰山虫草提取液对肝癌细胞的影响。用MTT实验检测泰山虫草对肝癌细胞增殖的影响。此外，我们还运用划痕实验，检测泰山虫草提取液处理对肝癌细胞迁移的影响，并用western blot实验检测细胞相关迁移蛋白marker的蛋白水平。本实验通过理论与实践相结合，在细胞水平上验证虫草的抗癌功效，设置严格对照，实验严谨，说服力强。

3.  技术路线

4.  实验内容

4.1实验材料

泰山虫草  肝癌细胞（Huh7   7721）  肝癌细胞培养基  胰酶  PBS

4.2实验方法

（1）虫草提取液的制作（2）肿瘤细胞的培养（3）MTT检测细胞活力（4）western blot检测迁移蛋白的表达（5）划痕实验观察细胞迁移

4.3实验步骤

4.3.1制备泰山虫草提取液：

4.3.2肿瘤细胞的培养：

4.3.3用泰山虫草提取液处理肿瘤细胞

4.3.4检测细胞的增殖和细胞迁移

（详情见竞赛设计和综述）

5.  研究成果

目前，我们发现泰山虫草能够抑制肝癌细胞增殖。我们配制了0.1g/ml的虫草溶液（55℃），设置不同浓度的梯度来处理肝癌细胞Huh7，并在不同时间通过MTT实验检测吸光度。以下是我们的实验结果：

实验一：

图1  24h处理结果                                        图2  48h处理结果      

实验二（重复）：                                           

图3  24h处理结果                                         图4  48h处理结果               

以上两组实验是两个重复，图像显示不同时间处理结果一样：虫草提取液可以抑制肝癌细胞Huh7的增殖，抑制作用与浓度相关性不大。

实验三：我们又设置了高浓度梯度，观察抑制作用与浓度的关系，结果如下图：

图5 泰山虫草提取液的量

实验结果和实验一、二是相同的，此实验进一步证明虫草提取液可以抑制肝癌细胞Huh7的增殖，作用效果与浓度没有关系。接下来，我们又设置了不同温度梯度的虫草提取液来探究对肝癌细胞Huh7增殖的影响。结果如下：

实验四：

图6  加2μl虫草提取液处理结果                             图7  加20μl虫草提取液处理结果

因此，起到抗癌作用的主要物质应该不是虫草多糖（虫草内主要成分是虫草多糖，90度高温不变性），但查阅论文知，多糖在小鼠瘤组织中起作用^{[22] [23]}，我们推测：抑制癌细胞增殖的成分有多种，且在不同温度下，各种成分的活性不同，我们未来将进一步探究其中有效成分。同时，并不是随着温度的增高，泰山虫草对肝癌细胞抑制作用增强，最适温度在50度左右^[24][25]，在不同高低浓度的虫草提取液处理下结果都一样。因此泰山虫草提取液可以抑制肝癌细胞Huh7的增殖，且在50℃左右提取的泰山虫草浸出液抗癌作用最佳。接下来运用细胞划痕技术^[26]，检测肝癌细胞经泰山虫草提取液处理前后的迁移情况。

实验七：

图8    迁移实验  

由实验结果可以明显看出泰山虫草提取液可以抑制肝癌细胞7721的迁移，并促进其凋亡。接下来我们用western blot实验检测细胞迁移相关分子的表达，以探究泰山虫草提取液对细胞迁移的影响。

实验八：（55℃下配置0.1g/ml虫草提取液处理肝癌细胞7721）

    该实验主要探究泰山虫草提取液处理细胞前后细胞中各种主要蛋白含量的变化，蛋白质Actin、Ki67、MMP9、CDH2等都是对肝癌细胞的增殖和迁移有重要作用的蛋白质。

以下是这次实验的结果：（数字表示加药量，单位：μl）

图9 迁移蛋白实验

由上图显示，与actin进行对照得出，加药的条带比未加药的条带的细，证明泰山虫草提取液可以抑制肝癌细胞7721的迁移，且浓度越高越抑制迁移。 

我们正在探寻泰山虫草对肝癌细胞Huh7迁移的影响以及观察泰山虫草提取液对肝癌细胞形态的影响。另外，我们会用琼脂糖凝胶电泳分析肿瘤细胞DNA降解情况。未来，我们将进一步探究泰山虫草对肝癌细胞系影响的深层机制。

学术名词：

①喷司他丁：喷司他丁是拟嘌呤类的抗肿瘤药,是一种腺苷脱氨酶(ADA)的强抑制剂。

②虫草素：虫草素学名为3"脱氧腺苷，是从蛹虫草中提取出来的一种天然生物活性物质。

③泰山虫草：是在泰山特殊地理环境下，经过长期的自然选择驯化而形成具有特殊医学价值的珍稀食用真菌类。

④冬虫夏草：冬虫夏草（Cordyceps sinensis），别称冬虫草，是冬虫夏草菌和蝙蝠蛾科幼虫的复合体。

⑤SMMC-7721：一种肝癌细胞

⑥MTT：MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。

⑦Western Blot：蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。

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