• 汇集公众科学智慧交流科学思想见解
  • 点燃科学智慧火花构建互动交流平台
科学智慧火花
科学视点

防御素——神奇的广谱抗菌多肽

作者: 王义琴 孙勇如 【字号: 访问量:

前言:防御素是广泛存在于动物、植物及昆虫体内的一类小分子短肽,它能抵御细菌、真菌或病毒等微生物入侵,是生物体免疫系统的组成部分。由于其特殊的毒性机理使得微生物难以产生抗性,所以由基因工程途径生产的防御素有望成为新一代的多肽抗生素类药物,从而解决目前日益严重的抗生素耐药性问题。

一、防御素的发现及分类

1980 年,美国 Robert Lehrer 实验室从兔肺巨噬细胞中首先分离得到了一种阳离子性极强的小分子抗菌肽并把它命名为防御素。后来发现防御素在生物界是广泛存在的,它通常由29~54个氨基酸组成,其中包括6~8个保守半胱氨酸,可通过半胱氨酸分子内二硫键使肽环形成反向平行的β片状或α螺旋结构。防御素分子结构稳定且具有非常广谱的抗菌活性,根据来源的不同,可分为动物防御素、植物防御素和昆虫防御素;根据分子结构特征的不同,动物防御素可分为α-防御素、β-防御素和θ-防御素3种(图1.)。

图1. 防御素的分类

α-防御素: 最早从兔肺巨噬细胞中分离得到的就是α-防御素,它主要存在于哺乳动物有关组织和细胞中,由29~35个氨基酸组成, 富含精氨酸, 非常保守的6个半胱氨酸以Cys-l-Cys-6、Cys-2-Cys-4、Cys-3-Cys-5方式形成3对分子内二硫键, 其中Cys-l-Cys-6对二硫键连接N端和C端的半胱氨酸形成分子大环, 所以α-防御素的一级结构一般为圆形。在兔的中性粒细胞中共发现有6 种α-防御素, 即RabNP-1、-2、-3a、-3b、-4、-5, 这些防御素总量占细胞蛋白质总量的15%~20%。它们和人的防御素氨基酸序列相似性特别高,特别是半胱氨酸的位置是相当保守的(图2.)。

 

图2. α-防御素的序列结构特征

RaNP-1具有非常广谱的抑菌谱,它对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、被膜病毒、真菌、梅毒螺旋体等等都有很强的抗性,所以对这么广范围的病原体都能有治疗效果(图3.)。

图3. 兔防御素RaNP-1广谱的抑菌谱

β-防御素也有三对分子内的二硫键,但是形成的位置跟α-防御素不同,因此三维结构不一样。防御素的抗菌活性很强,但是在受到盐浓度及血清成分影响下,α-和β-防御素的抗菌活性会有所降低, 但是只有12个氨基酸的θ-防御素的抗菌活性却几乎不受影响, 研究发现θ-防御素分子的环状结构可能是其保持稳定活性的原因(图4.)。

图4. 动物防御素的分类和特点

昆虫防御素是1989年由法国学者Hoffmann等人首先分离得到, 它与兔子肺吞噬细胞防御素分子同源。昆虫防御素大量存在于昆虫血淋巴液中, 至今已在昆虫纲动物体内发现了数十种防御素和抗菌肽。植物防御素是1990年由Mendez等最早从小麦、大麦种子中分离得到的,用NMR光谱法测定植物防御素r1-P和r1-H的三维结构,发现与哺乳动物和昆虫防御素的结构有相似之处。与动物防御素相比,昆虫和植物防御素均有保守的分子内二硫键,昆虫防御素三对二硫键是Cys-1-Cys-4、Cys-2-Cys-5、Cys-3-Cys-6,但是植物防御素通常是有四对二硫键Cys-1-Cys-8、Cys-2-Cys-5、Cys-3-Cys-6、Cys-4-Cys-7(图5.)。

图5. 昆虫和植物防御素的特点

二、防御素的抗病机理研究进展

防御素有如此广谱的抗性是在生物体长期进化过程中与疾病斗争的结果。其抗微生物的作用机理可以分为抗菌作用机理、抗病毒的作用机理、细胞毒作用、免疫调节功能四个方面(图6.)。

图6. 防御素的抗病机理

防御素抗菌的作用机理:目前有两种不同的抗菌作用机理被提出,一种是独立膜机制,另一种是防御素结合细胞内复合物的机制。独立膜机制的观点认为,带正电荷的防御素与带负电荷的细菌细胞膜相互吸引并结合,从而破坏了磷脂双分子层的完整性,引起靶细胞膜出现裂隙。可分为三个阶段:(1)静电吸引,防御素与靶细胞膜结合。防御素带正电荷,可通过静电作用与带负电荷的细菌膜脂层结合;(2)通道形成。带正电荷的防御素分子或其多聚体则与细菌质膜上带负电荷的磷脂头部和水分子相互作用,显著地增加生物膜的通透性。防御素作用于膜上形成稳定的多个通道;(3)内容物外泄。通道形成后,防御素进入细胞内的同时,其他胞外分子也伴随进入(如肽、蛋白质或无机离子),而靶细胞的重要物质(如盐离子和大分子)渗出,细胞膜的通透性及细胞能量状态受到了破坏,导致细胞膜去极化,呼吸作用受到抑制以及细胞ATP含量下降, 离子和大分子物质通过细菌的细胞膜, 最终导致靶细胞死亡。

 

图7. 防御素破坏微生物细胞膜的抗菌机理

防御素与细胞内复合物结合的抗菌机理:2013年在美国科学院院报PNAS上有篇文章报道发现人类β-防御素2在革兰氏阳性菌粪肠球菌毒力因子局部合成点高度聚集,从而破坏转肽酶Sortase的定位并影响了它的功能,导致毒力因子合成受阻,从而破坏细菌分裂达到杀菌的作用。

防御素抗病毒的作用机理:分三类,闭门羹、突破口、地雷阵。

闭门羹-阻止病毒入侵宿主细胞,病毒感染细胞采用“两步走”政策:首先,病毒的外衣即包膜死缠烂打地粘着到细胞的外膜上;接着,病毒包膜与细胞膜融合在一起。两个膜融合后,病毒就将它的遗传物质插入到细胞中。防御素则斜插在糖蛋白上以防病毒向细胞糖蛋白的扩散,让病毒吃个“闭门羹”无法进入细胞。没能进入细胞的病毒接着会被免疫系统的细胞摧毁。

突破口-杀灭病毒,防御素通常带多个正的净电核,病毒囊膜及其表面糖蛋白通常带负电。这使得防御素像一块块小磁铁,吸附到病毒囊膜带负电荷的糖蛋白上。这样便使囊膜病毒穿孔,形成突破口,内容物外泄而死亡。这与防御素对细菌的杀灭作用相类似。

地雷阵-阻止病毒基因复制与转录,万一病毒进入细胞内,防御素可以与细胞膜表面促肾上腺皮质激素 (ACTH),人硫酸肝素糖蛋白(HSPG),低密度脂蛋白受体(LDLR)等相结合,从而启动G蛋白偶联型受体的级联放大反应,进一步激活磷酸激酶C。这些细胞信使作用就像埋伏在胞内的地雷,可以阻止整合到宿主基因组之前的病毒复合体进入细胞核或者阻止病毒的基因转录。整合不到宿主基因组的病毒随后被摧毁。病毒虽然进入细胞,但是碰到地雷就被阻止了,整合不到基因组就被消灭掉了。

防御素的细胞毒作用:随着研究发现,人们发现防御素有细胞毒作用,它对人的淋巴细胞、实体瘤细胞毒作用更显著的,近些年来,发表了一系列的这方面的研究文章。早在1993年,在我们国家的《中国病理生理杂志》,就有一位科技工作者做了兔中性细胞防御素的细胞毒研究,随着浓度的升高,RaNP-1和RaNP-2对HL-60细胞系的毒性是逐渐增强的。对抗 TNF 的 U9TR 细胞、抗NK细胞细胞毒因子的小鼠淋巴瘤 YAC-1 细胞和人组织细胞淋巴瘤 U937 细胞具有杀伤性。在体外,HNP可抑制烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)氧化酶的活性,HNP的细胞毒活性部分依赖于靶细胞膜脂质成分的代谢活性,它还可以与过氧化氢酶协同诱导细胞毒作用。体外观察纯化防御素对人及小鼠数种肿瘤细胞的杀伤作用,发现防御素对白血病细胞系、淋巴瘤细胞系及实体瘤细胞均具有细胞毒作用,并且这种抗肿瘤功效与其作用时间和剂量呈正相关。

防御素的免疫调节作用:防御素能够作为一种效应分子激活巨噬细胞、DC、气管上皮细胞等细胞表面受体从而启动获得性免疫系统,并将先天性免疫和获得性免疫有机连接。防御素可以上调巨噬细胞趋化因子表达并进一步招募T细胞、单核细胞和未成熟树突状细胞(DC)和触发适应性免疫控制病毒感染。通过防御素肿瘤机理防御素是自身防御体系重要的组成部分,组成机理非常独特的,是通过电荷上去的,病原物不能产生抗药性。

三、防御素的研究进展

下面简单介绍一下防御素在医学、食品工业和畜牧业的研究进展。防御素在医学中的研究进展包括防御素与口腔黏膜疾病、炎症性肠病、慢性阻塞性肺部疾病的关系以及防御素的临床药用研究。

防御素与口腔黏膜疾病的关系:研究发现,防御素家族在口腔黏膜宿主防御及免疫应答过程中发挥着重要作用,与多种口腔黏膜疾病(口腔溃疡、扁平苔藓、白斑及口腔念珠菌病等)关系密切。现今关于这方面的研究尚处于起步阶段,主要以体外实验为主,其作用机制也多为推测。感受到病毒侵染的信号,人的黏膜上皮细胞会产生防御素β-defensin-2 (HBD2) and HBD3 来抵抗病毒,从而抑制了病毒的进一步侵染。

防御素与炎症性肠病的关系:研究发现,肠道上皮细胞中防御素起着影响肠道黏膜的天然屏障作用,防御素表达水平的降低会导致黏膜细菌附着并入侵机体引发炎症反应。肠道慢性炎症疾病克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)均与回肠潘氏细胞防御素HD-5、HD-6 的表达相关异常相关。原理是什么?2012年在Science发表的研究结果显示,以防御素为主的免疫分子能够制造纳米网捕捉沙门氏菌等肠道微生物,阻止这些病原微生物的进一步侵染。

图8. 以防御素为主的免疫分子能够制造纳米网捕捉肠道微生物(摘自Science.2012

防御素与慢性阻塞性肺部疾病的关系:HBD-2 与呼吸系统疾病关系紧密,在肺部黏膜防御中具有重要作用。研究证实,HBD-2 的产生或作用被抑制后,机体将发生肺部感染,人为补充外源性防御素可能会阻止细菌的定植和感染的发生。已有研究证实,重组 HBD-2 对肺损伤具有保护作用,可减少绿脓杆菌感染大鼠肺组织的菌落数。

最近的一篇报道是在猪里面表达β-防御素2基因(β-BD-2)增强对胸膜肺炎放线杆菌的抗性,野生型猪的肺部显示出血、水肿,严重的拥塞和嗜中性粒细胞浸润。转基因的猪肺部表现出轻微出血,中度充血,轻度中性粒细胞浸润。防御素的表达明显增强了生物体对胸膜肺炎放线杆菌的抗性。

防御素的临床药用研究 防御素有独特的抗病机理,微生物不容易产生抗药性,抗菌谱广,所以它在临床上有非常大的药用潜力。2008年,全球首个防御素药物(PMX-30063)在加拿大获得批准并进行一期临床试验。PMX-30063药物的特色包括全新的作用机制,细菌不易产生耐药性;对革兰氏阳性和阴性菌均有活性,特别是对包括89种耐药葡萄球菌在内的146种葡萄球菌有抗菌活性;是一种杀菌剂,即能直接杀灭细胞而且杀菌速度快于许多抗生素;对耐药菌有活性,包括多种耐万古霉素和耐甲氧西林的临床分离株。从而有望解决日渐增多的细菌耐药性问题!

国内研究是基于昆虫防御素的新分子设计,中国科学院动物研究所的朱顺义研究组通过单点突变将昆虫防御素羧基端β-折叠片层结构改造成典型的β-发夹肽结构,获得的14个氨基酸的小肽命名为NvBH。研究发现在低的微摩尔浓度下,NvBH无论在完全氧化或部分氧化的状态下均有较强的抑菌活性(包括一些耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌临床分离株)。NvBH具有低的溶血性和高的血清稳定性和蛋白酶抗性,使其有望成为一个新型的抗感染类药物先导物。希望他们早日研发成功。

防御素在食品工业和畜牧业中的研究进展:防御素作为小分子短肽,具有耐热的特点,因此可作为食品防腐剂用于热加工食品的防腐保鲜。此外,它还可被用于防止巴氏杀菌后的再污染。防御素在我国畜牧业中的研究进展很好。目前来讲,我们国家畜牧业养殖过程当中,抗生素添加剂的使用严重破坏了动物肠道的微生态平衡,药物残留也影响了畜产品的品质和人类健康,而来源于哺乳动物的防御素相对分子质量较小,热稳定性和水溶性均较好,可以在肠道内吸收。由于防御素属于多肽成分,在体内容易被蛋白酶降解为氨基酸,动物采食后在体内一般无残留。可以开发成环保型防御素饲料添加剂或兽药。目前已经有很多商品型的重组β-防御素在进行销售了。

防御素的基因工程研究进展 防御素的基因工程生产,以转基因小球藻为生物反应器生产兔防御素的研究具有自主知识产权,处于国际领先地位。小球藻是一个单细胞藻类,培养很简单。转基因小球藻的高效生物反应器特别有效,因为小球藻单细胞、培养简单;繁殖速度快、可大规模培养;无内毒素;蛋白、多糖含量高,营养价值高;可作为高效生物反应器平台。

另外,也有研究用酵母系统大规模重组表达防御素,除此之外,防御素在农业中可用于农作物抗病育种研究。我们课题组2001年将兔防御素 NP-1转入小麦植株,田间抗病虫鉴定结果显示小麦对于白粉病、叶锈和条锈病的抗性均有较大提高。而将兔防御素 NP-1基因构建至植物表达载体中获得转基因番茄的抗病实验结果表明,其对番茄青枯病具有抗性,为番茄的抗病育种工作奠定了基础。玉米防御素PDC1抑制了禾谷镰刀菌的生长,效果还是非常明显的。另外在小麦里面过表达植物防御素MtDef4.2的转基因小麦可显著增强对小麦叶锈菌的抗性。

图9. 真核单细胞藻类小球藻是一个高效生物反应器平台

图10. 用转基因小球藻表达兔防御素RaNP-1的流程

结束语-防御素的功能研究目前仅是发现了冰山一角

防御素的功能并不仅限于防御,随着目前研究的不断深入,人们发现防御素功能非常广谱。例如:HNP可成为儿童体重指数和腹部脂肪沉积的经典标记物;一个家犬β-防御素基因发生突变会导致家犬毛色的变化等等,这些结果拓展了科学家对防御素在生物体中的功能的认识。毫不夸张地说,防御素的功能研究目前只是发现冰山一角,更多的未知功能正等待深入发掘……


作者简介:
王义琴,中国科学院遗传与发育生物学研究所博士,副研究员。曾作为项目主持人和子项目主持人承担了国家海洋863资源与环境技术领域海洋生物技术青年基金项目“小球藻转基因关键技术的研究”和自由探索项目“转兔防御素基因小球藻高密度异养培养工艺优化与过程放大技术研究”,目前从事水稻功能基因组研究。发表学术论文52篇,发明专利3项,获得省部级奖励2项。

孙勇如:中国科学院遗传与发育生物学研究所研究员,1963年毕业于北大生物系。曾主持国家“九五”科技攻关项目“藻类大规模培养生产生物活性物质”的研究,在国内外首次开创了用转基因小球藻高效表达兔防御素的研究,拥有“兔防御素基因的植物表达载体质粒”和“转基因小球藻的高效生物反应器”两项授权专利。