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甲基化导致的疏水性控制基因的表达 ——祝贺中科院食蟹猴克隆成功

投稿时间:2018-01-31 18:05 投稿人:王孝恩 【字号: 访问量:

2018新年伊始,中科院就传来了好消息:世界首例体细胞克隆猴在中国诞生。我依据新闻报道中的论文连接,阅读了刘震(Zhen Liu)小组在著名英文杂志《Cell》上的原文[1]

该文使我感兴趣的有两点。第一点,他们用两组来源的猴细胞做的实验。第一组用了猴胎成纤维细胞(属于胚胎体细胞),在21只代孕母猴中有6只怀孕,并且产下了两只健康的贝贝(取名中中和华华);第二组用了成年猴的堆积体细胞(cumulus cells)核,在42只代孕母猴中有22只怀孕,最后产下了两只短命的小猴。这些实验结果证明了我在《端粒磨损,还是端粒缠绕阻碍了复制?》[2]一文中提出的假设,即,端粒酶只能以双链DNA分子中端粒部分的长链为模板,使短链延长补齐,而不能将双链都短的端粒延长。成年猴的体细胞中的DNA端粒部分经过多次分化分裂,由于缠绕阻碍了端粒复制而磨损至短,即便移入卵细胞核中,端粒酶也不能将它们恢复到正常胚胎时的长度。因此用成年猴的体细胞核进行的移植得到的只能是短命的后代。

第二点,也是本文要讨论的重点。刘震等在体细胞移植的单细胞阶段,注射了H3K9me3去甲基化酶Kdm4dmRNA,并且用组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古柳菌素A(trichostatin A)进行了处理。

组蛋白的甲基化或乙酰化修饰都是重要的表观遗传控制。现在人们已经知道,基因表达的遗传控制,不只由DNA的碱基序列决定,而且还受DNA的甲基化及形成核小体的组蛋白的翻译后修饰的影响,并将后者归于表观遗传学的研究范围。

构成核小体的组蛋白主要有四种:H2A、H2B、H3及H4,它们都具有典型的球状组蛋白折叠结构域(histone fold),有利于相互聚合成致密的核心区。通常由2个(H2A-H2B)二聚体和1个(H3-H4)2四聚体形成一个八聚体的核小体核,周围再缠绕上146个碱基对的DNA链段,就构成了一个标准的核小体。相邻的两个核小体之间由连接DNA片段(linker DNA)和连接组蛋白H1共同连接。各组蛋白的N端和C端的柔性尾巴由于带电荷而产生的亲水性通常使它们易于伸出到核小体外面的核浆中。受环境影响这些尾巴很容易发生翻译后修饰(PTMs),包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、SUMO化和ADP核糖基化修饰等。其中研究最多而且作用机理最为清楚的,是发生在残基赖氨酸侧链ε氨基上的组蛋白乙酰化。最早被鉴定的组蛋白乙酰化酶和去乙酰化酶是四膜虫GCN5和人源Rpd3[3]

在组蛋白尾巴段的赖氨酸残基为带正电荷的有机铵基团,通常它与DNA分子内连接两个核糖的磷酸基中的酸羟基(常电离为酸根阴离子)靠正负电荷吸引而结合。这种结合就像一段柔软的绳子将DNA链段与核小体绑在了一起,因此削弱了DNA的转录活性。当这样的赖氨酸残基的翻译后乙酰化修饰的结果,使带正电荷的铵基变成了不带电荷的亚胺基,不能再与DNA片段锁定,从而增强了DNA片段的转录活性。组蛋白的甲基化修饰也发生在赖氨酸残基上,但往往与乙酰化的位点不同。除乙酰化以外的其它组蛋白的翻译后修饰,作用机理都比较复杂。

在微观的生物分子层次上,除了电性相互作用外,还有一类重要的相互作用,被描述为疏水键。我在2006年的一文[4]中,比较了RNA与DNA在核糖和脱氧核糖,碱基与碱基之间的结构与疏水性的差异。我认为DNA分子中CpG岛的甲基化、核小体组蛋白的甲基化及去磷酸化等化学修饰,都会增加染色质丝的疏水性。根据我在前文[5,6]中提出的观点,沿染色质丝或DNA分子链的微水流机制是影响DNA复制及基因表达的一种重要机理。疏水性的增加必然减弱这种作用的活性。这一观点不断受到新发现的支持,例如,M. B. Poulin等[7]发现,甲基化通路调节的丢失被涉及到发育紊乱和肿瘤的发生,发生甲基化的赖氨酸的位置及同一氨基被甲基化的甲基数量对基因的是否表达有着重要影响。但他们只能认为这种影响是复杂的,并没有找出其中的原因。

刘震他们对核移植后的单细胞采取的促去甲基化和抑制去乙酰化,增强了染色质丝的亲水性和DNA的转录活性,克服了沿微纤维表面微水流的流动阻力,促进了第一次分裂前的纺锤体的建立,这可能就是他们成功的原因所在。动物体细胞克隆的两大难点,就在于初次分裂时纺锤体、微流体系统的建立,及成年体细胞DNA分子中端粒的延长。

2016年,L. N. Voong等[8]发现,占据着DNA的转录开始与转录停止位点的是一类比较脆性的核小体。它们控制着DNA与转录装置的可接近性,也就是控制着基因的表达。DNA分子中的CpG岛通常是位于基因之前的起动子区段。CpG代表的是胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)相邻的双碱基,中间的p表示连接两个碱基的核糖的磷酸基。C、G不但是DNA双链通过A-T和C-G可以相互配对的一对碱基,也是最易发生疏水性(或亲水性)修饰的两个碱基。一条链上的CpG双碱基,必定导致在另一偶合链上的GpC双碱基。一条链上密集的CpG双碱基分布链段,必定导致另一链上相应的密集的GpC双碱基。最终导致双链的密集的GpC(或GpC)链段,因此人们将这样的区段称为CpG岛。

目前表观遗传学研究主要集中在DNA的甲基化、蛋白质修饰、小RNA和染色质重塑等方面。DNA甲基化的发现是一个重要标志,1979年Mc Ghee等发现与鸡β珠蛋白基因比邻的胞嘧啶核苷酸甲基化后,该基因的转录受到抑制。但酵母和果蝇等不依赖DNA甲基化的方式来控制基因活性。脊椎动物与高等植物普遍利用DNA甲基化作为基因表达的重要调控机制。

哺乳动物基因组中约有5%-10%是CpG位点,其中有70%的胞嘧啶被甲基化(mCpG)。CpG 位点并不均匀分布,而是呈现局部聚集倾向,形成CpG双核苷酸相对聚集的CpG岛。

CpG岛主要位于基因的启动子区,少量位于基因的第一个外显子区;其甲基化状态直接影响基因表达。甲基化的CpG双核苷酸通过募集转录抑制因子或者阻碍转录激活因子的结合抑制基因的表达。一般CpG岛是未被甲基化的,但在失活的X染色体、印记基因和非表达的组织特异基因中则是甲基化的。成体基因组中,通常奢侈基因呈现高密度甲基化而含有丰富CpG岛的管家基因则呈非甲基化。

在双股DNA形成的长的染色质丝中,由于DNA的甲基化、核小体组蛋白尾巴的修饰,使得各段显示不同的疏水性变化。在核浆中,通常那些疏水性比较强的染色丝段,当然也是那些基因失活的部分或整个失活的染色体,会聚集到核的某些边缘形成异染色质区。而那些亲水性比较强的片段往往聚集在一起,形成核糖RNA大量合成的区域。这一区域由于亲水性强,通常显示为透明区——核仁区。亲水性在上述两者之间的染色质部分,分散于大部分核浆区形成常染色质区,从事正常的基因转录。核仁区活跃的微水流作用可能影响与其相邻的基因的启动子的去甲基化,通过表观遗传机制将这种去甲基化模式传递给下一代细胞,从而启动下代细胞中该基因的表达。因此,特定组织中哪一代细胞中的哪些基因将被表达,应该由它的上一代细胞决定。这种机制可能决定了组织分化中哪一代细胞应表达哪些基因。

同样,在某一代细胞中表达被削弱的那些基因,它们的染色质丝会被疏水性修饰,并被边缘化到异染色质区,并且它们的启动子区易被甲基化。这种甲基化通过表观遗传机制传递到下一代细胞,该基因就变成了沉默基因。 

参考文献:

1. Zhen Liu, Yijun Cai, Yan Wang, Yanhong Nie, Chenchen Zhang, Yuting Xu, Xiaotong Zhang, Yong Lu, Zhanyang Wang, Muming Poo,Qiang Sun.  Cloning of Macaque Monkeys by Somatic Cell Nuclear Transfer. J. cell 2018 01 02. http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(18)30057-6.

2. 王孝恩,端粒磨损,还是端粒缠绕阻碍了复制?中科院科学智慧火花 2016-06-28

3. 曹端方,杨娜. 组蛋白去乙酰化酶的结构及应用. 生物化学与生物物理进展,2015,42(11):978-993.

4、王孝恩 RNA和DNA之间的结构变化显示的疏性性差异. 潍坊教育学院学报, 2006年,第19卷第四期第10-13页.

5、王孝恩,细胞周期检查站的工作原理,中科院科学智慧火花 2016-04-30.

6、王孝恩,动物克隆失败的原因,中科院科学智慧火花 2017-04-05.

7、Myles B. Poulin et. al. Transition state for the NSD2-catalyzed methylation of histone H3 lysine 36. PNAS 2016 113 (5) 1197-1201.

8、Lilien N. Voong, Liqun Xi, Amy C. Sebeson, Bin Xiong, Ji-Ping Wang. Insights into Nucleosome Organization in Mouse Embryonic Stem Cells through Chemical Mapping. Cell. Volume 167, Issue 6, p1555-1570, 1 December 2016.