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新型微纳光学操控和检测方法在生命科学研究中的应用

主办单位: 中国科学院老科协
承办单位:中国科学院老科学技术工作者协会物理所分会
举办时间:2020-09-09       【字号: 访问量:

目录

1、简介        
2、主持人致辞        
3、主旨报告            
4、邀请报告            
5、讨论(沙龙讨论在报告过程中)        
参会专家简介:
  1. 吴令安(主持人)老科协物理所分会理事长、物理所光物理实验室研究员
  2. 吕惠宾(主旨报告) 物理所研究员,研究方向为光物理和材料科学。先后从事激光器件与探测、表面非线性光学、超导薄膜与物性、激光分子束外延、原子尺度控制氧化物薄膜和异质结的制备与物性研究等工作。获国家科技进步三等奖3次,国家专利局优秀专利奖1次。2001年2月被国家科技部授予863计划十周年先进个人。2002年获美国摩托罗拉中国研究发展院"Accomplishment Award"。2012—2019年为973项目材料领域专家咨询组成员。
  3. 郭红莲(邀请报告) 中央民族大学教授。主要从事单光镊、双光镊、多光镊以及矢量光束光镊、拉曼光镊等技术研究及应用,介质颗粒及金属纳米颗粒的捕获、操纵、排列及力学性质及光谱特性测量,细胞、生物大分子的力学性质、光谱特性测量及光声成像等研究。
  4. (以下按姓氏笔画排列)
  5. 左战春 物理所光物理实验室副研究员
  6. 冯宝华   物理所光物理实验室研究员
  7. 何  萌 物理所光物理实验室高级实验师
  8. 何远光   中科院老科协顾问、原执行理事长,中科院离退休工作局原局长
  9. 厚美瑛  物理所软物质验室研究员
  10. 桂文庄 中科院老科协副理事长,中科院原高技术局局长,研究员
  11. 郭沁林 物理所表面实验室研究员
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【简介】

生物大分子纳米结构、功能和相互作用的研究是生命科学中十分重要的研究内容之一。目前的研究特点是趋向“两极”:一方面努力发展并行、无标记和高通量的分析和检测方法与技术,对大量生物分子相互作用进行快速、整体、动态性的研究,以适应基因组、蛋白质组等相关研究的需要;另一方面努力发展单个生物分子、单细胞的操纵和检测技术,力图在单个分子水平上,更加精确和直接地揭示大分子之间相互作用及生物纳米结构和功能的特性。因此,发展无标记、纳米水平的相关检测方法和技术,已成为生命科学研究取得重大和突破进展的关键之一。2018年的诺贝尔物理学奖授予包括光镊及其在生物系统应用的三位科学家,充分说明了微纳光学方法和技术在生命科学研究中应用的重要意义。本次沙龙对微纳光学操控和检测方法的新进展进行讨论。

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【主持人致词】

吴令安:欢迎大家,因为疫情关系,今年一直没能活动。很高兴今天能够在这里举办学术沙龙。今天是两位报告人,吕惠宾教授和郭红莲教授。吕惠宾教授今天的报告题目是“新型微纳光学操控和检测方法在生命科学研究中的应用”,欢迎!

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【主旨报告】

 

吕惠宾:新型微纳光学操控和检测方法在生命科学研究中的应用

各位领导、专家、同事,早上好!因为是沙龙,我讲的过程中,大家可以随时打断,一起讨论可能更好一点。

我今天报告的题目是《新型微纳光学操控和检测方法在生命科学研究中的应用》,我先简单的介绍一下这个工作的研究意义。

一、背景和意义

一说起生命科学,大家都知道,不管是研究队伍还是研究经费,在所有研究领域中都是最多的。因为生命科学关乎到人的生、老、病、死,也就是人的一生。因为生命科学是个非常复杂的系统,所以跟物理、化学比较起来,这个系统要复杂得多。整个生命科学最基础的研究,跟物理化学的相比,因为它太复杂,从深入的角度来说,还没有物理化学那么深入。

对于生命科学的基础研究来说,生物分子之间相互作用的研究,应该是最基础的研究。但生物分子不仅种类多,而且结构复杂。如DNA有109种,蛋白质、糖类和脂类都是104种,至于小分子有多少种,有的人说是1013,有的人说是1020,到目前为止谁也说不清楚。

所以不管是核酸,还是蛋白、糖类,每一种分子都有成千上万种,分子之间的作用是非常复杂的,这些数据完全是海量的数据。

 

图1、生物分子、病毒和细胞的尺度

从图1可以看出,生物分子、病毒和细胞的尺度是从1纳米到10微米,尺度跨越10的4次方。

近些年来,生命科学的研究取得了非常大的进展和突破。比如说以前治不了的好多病现在可以治了,但大家也在问:为什么不能更早的发现和预防呢?如果我们仔细分析一下,实际上生命科学的大部分进展和突破,相当一部分都是技术和方法,真正从基础的研究,从分子相互作用最基本的研究来讲,确实是突破不是很大,因为太复杂了。

又比如我们吃药,治高血压的药有好多种,治感冒的药也有好多种,但对于不同的人要吃不同的药,人的各异性很强。在美国药监局注册的药物超过了两千种,但两千多种的西药里边,到目前为止还没有一种药敢说它没有副作用。就是因为对于分子之间的相互作用搞不清楚,只知道这种药可以治这种病,可以杀死相关的病毒、细菌去治这种病,但是它还跟其它的那些分子作用,作用结果是什么?不知道,是好是坏不知道,所以说“是药三分毒”,就是因为最基本的东西我们没有搞清楚。

大家知道,生命科学这一块发表论文的引用率很高。为什么这么高呢?大家可能也都知道,生命科学中做实验的时候,到目前为止,实验的成功率大概不到50%。确切的说,大部分的成功率只有30%到40%。为什么这样?就是因为几乎所有的抗原、抗体等生物样品,在商店买的时候,没有任何参数。不像是我们搞物理的,我们买一个什么,回来以后,它的参数是什么,它是什么结构,什么取向,这些全有,不合适我可以退换。所以生命科学这一块,买样品的时候不敢多买,只敢买一点,因为买回来以后不能用是没法退的。所以发表论文的时候,都要注明用的核酸、用的蛋白,是哪一个公司的,哪一批号,全都注明。因为如果别人做这个实验,用的不是这个公司、不是这个批号的,很可能做不出,所以相关的参数和论文都要引用。

我们搞物理化学的,做几次实验,就可能总结出一些规律的东西,但是对生命科学,往往很难有规律可遵循,因为它的个异性非常的强,所以也就是吃药的时候,为什么同一种病有不同的药,就是因为个异性非常的强。

另一个就是个体和群体差异也很大,比如说肝的癌细胞,如果它在活的细胞体里的时候,它表现出来的是肝癌特性,但是你把它拿出来,完全不是那么回事了,所以个体和整体的相互作用,检测还是比较困难的。

包括基因检测,10多年前,有人认为把基因的序测出来,好多问题就解决了。开始大家都很兴奋,随着工作的深入,感觉到问题不是那么简单,比如人的基因大概有3万多种,开始都认为主要是编码基因调控功能,最后随着工作的深入,逐渐发现有些非编码的基因调控功能也很大,是编码基因和非编码基因相互作用在起作用,似乎越研究感觉越复杂。

典型的是新冠肺炎病毒,折腾得全世界都不安宁,尽管现在研制出不同的疫苗,但还难说就能解决根本问题。其原因还是因为生物分子间的相互作用,到目前为止我们了解得还非常有限。

我也请教过国内外的一些生命科学专家,包括美国约翰霍普金斯大学的两位教授,我说我是搞物理的,对生物不了解,不知道我的理解对不对?从我的角度感觉生命科学,目前还是“实验生物学”,我说这样理解对不对?他们都想一下,回答都是说“也可以这样说”。

因此,我们认为对生物大分子相互作用的研究,目前是趋向两极。一个是针对基因组和蛋白质组,需要并行、高通量检测,可以快速、大量、整体、动态的去检测分子的相互作用。另外一个是单分子、单细胞检测,能够精确、直接的揭示相互作用的特性,单个分子和单个分子与多个分子相互作用,其特性是完全不一样的,单个分子在群体中与把它从群体中拉出来是完全不同的。

所以我们今天的两个报告,就是针对上述的两个需求。我前面讲的这些也算是一个开场白吧。

二、无标记、高通量检测的斜入射光反射差方法

下面我重点介绍一种适合无标记、高通量检测的斜入射光反射差方法。一会儿郭红莲教授的报告是针对单分子、单细胞操控和检测的光镊及其应用。

首先,简单介绍一下斜入射光反射差法的研究意义。不同种类的生物分子都是成千上万的,为了研究生物分子的相互作用,就出现了生物芯片,生物芯片技术目前已非常成熟。如图2所示,标准的生物芯片,基本上是两个厘米宽,五厘米长的一个玻璃片。在一个芯片上面,可以点制多至五、六万个生物分子样点,对研究生物分子的相互作用是非常有利的。

 

图2、生物芯片的制备

在生物分子检测这一方面,检测的技术和方法还是比较有限的,直到目前为止,占主导地位的还是标记的方法。因为直接检测生物分子的相互作用难以检测,就给参加反应的一种分子打上记号,如图3所示,最典型的是荧光标记,也就是把荧光分子结合在参加反应的一种分子上面,这样检测荧光,我们就可以知道结合还是没结合。现在所有能标记的方法,几乎全都用上去了。

所以我们今天的两个报告,就是针对上述的两个需求。我前面讲的这些也算是一个开场白吧。

 

图3、生物分子的标记

 

图4、荧光标记的高通量生物芯片

图4是发表在Science上的第一个高通量生物芯片,在一个芯片上点制了近万个蛋白质样品点。因此普遍认为,生物芯片是20世纪具有划时代意义的微量分析技术之一。也有人说20世纪是微电子芯片的世纪,21世纪将是生物芯片的世纪,这个说法大家还是认同的。

荧光标记,灵敏度非常的高,也可以说是所有检测技术中灵敏度是最高的,没有其他方法可以跟它比的。对标记方法来说,尽管可以实现高通量检测,但其不足之处也是非常明显的。对我们搞物理的人来说是很容易理解。1、可能引起生物分子结构和活性的改变。2、难以获得反应的动力学曲线和参数。3、生物小分子目前无法标记。另外,标记的过程非常复杂,成本也很高。因此,对非标记、高通量的检测技术和方法就提出了非常高的需求。

(讨论)

左战春:那个荧光分子一般用什么物质?

吕惠宾:也就是染料,把可以激发出荧光的染料分子连接在参加反应的一种分子上。这个方法已经非常成熟,我没具体做过,但对做生命科学研究的人来说是非常成熟的技术。但并不是所有的生物分子都可以标记,尤其是小分子。

吴令安:怎么决定我选什么样的分子?

吕惠宾:比如有一种抗原和几种抗体,你想知道这种抗原能与其中的那些抗体结合?就可以把不同的抗体点制在芯片上,把抗原进行标记,然后让标记的抗原与芯片反应,检测后,有荧光点的抗体就是与抗原反应,没有荧光点的抗体就不与该抗原反应。

目前代表性的无标记检测方法就是表面等离子体共振仪(SPR)和表面等离子体共振摄像仪(SPRi),SPR测得的是曲线,SPRi是拍照片。这种技术最大的特点是无标记,灵敏度比较高。缺点是:第一,它要求芯片的表面要有几十个纳米的一个金属层,而且对金属层的要求也很高,成本高。第二,通量还不够高,到目前为止,一次检测最多不到一千个点。

(讨论)

郭沁林:吕老师你这个概念跟一般说的固体的共振有很大不同吗?

吕惠宾:应该有所不同,固体的共振一般是体效应,这个是表面效应。

郭沁林:为什么有“表面”两个字呢?没有这两个字不行吗?你这写了个表面等离子体,给我感觉是还有体的等离子?概念是一样的吗?

吕惠宾:SPR是利用了金属薄膜耦合产生的一种物理光学现象。入射光的波向量与金属膜表面电子(等离子体)的共振频率相匹配时,光线既被耦合进入金属膜,引起电子发生共振-SPR。为什么用“表面”这个词呢?因为我们把生物分子固定在玻片的表面,目的是检测生物分子之间的相互作用,因此用的是表面效应。

对于生命科学来说,到目前为止,对无标记的检测技术和方法还是非常急需的。对我们国家来说,生命科学领域有原始创新和自主知识产权的仪器设备基本没有,这是科技部相关发展规划的文件中指出的。从整个生命科学领域来说,所用检测技术和方法,绝大部分是借助物理和化学的,生命科学领域自身发展的技术并不多,对于我们国家来说,这方面还是更欠缺一些,每一年进口的仪器设备中,生命科学领域占的比例是比较大的。

现在整个生命科学研究领域,还缺乏无标记、高通量的检测方法和设备。如果无标记和高通量的检测方法能广泛应用,会对生命科学领域产生革命性的影响。因此,对于分子之间相互作用的研究来说,无标记、高通量、实时、动态的检测,是非常关键的一个需求。

(讨论)

吴令安:你这个所谓的无标记指的是什么?

吕惠宾:比如研究蛋白和蛋白、DNA和DNA或蛋白质和DNA相互作用,不需要对参加反应的任何分子进行标记,就可以直接检测出来其是否发生反应,这叫做无标记。不管你通过什么方法和手段,你只要能检测出反应结果就可以。虽然我眼睛看不见,但能得到是否反应的信号就可以了。

吴令安:现在能看见单原子的,为什么你这个看不见呢?

吕惠宾:能看到单原子的方法还非常有限,包括固体物理在里边,真正能够检测到单分子及其行动轨迹的就更有限的,即使有,能不能用到生命科学这里来还是个大问号。

厚美瑛:为什么分子要去标记它?

吕惠宾:不标记检测不出来,分子间反应不反应我们就不知道。比如这一种抗原,跟几种抗体起反应,哪样抗体能结合、哪样不能结合,如果不标记我就不知道,检测不出来。假如我对每一个抗原都进行荧光标记了,抗原和这些抗体反应后,用激发荧光的方法去检测,那个抗体的样点发光,说明抗原跟这个抗体结合了,如果不发光,说明它们没结合。

左战春:在医院做B超还是做什么,喝那个造影液,喝完了就发光了。

吕惠宾:有点类似。喝造影液相当于一种靶向的分子,它很容易跟癌细胞等结合,所以信号就增强了,就检测到了。染色也好、标记也好,都是一些辅助的检测手段,就是我看不见,如何使得它能够看见,或者说如何增强检测,这是目的。

下面我具体介绍一下斜入射光反射差法。我先简单介绍光反射差法到底是什么方法?因为这种方法对搞光学的人来说,大概真正了解的人也不是太多。

 

图5、斜入射光反射差法原理示意图

OIRD的基本原理是通过测量斜入射到被检测物质表面反射光的s和p两个偏振分量的差值,来检测表面物质在微纳尺度的变化和特性。

我们都知道,假如一束光垂直入射到一个表面,不论入射光的偏振方向如何,表面对入射光的反射率是一样的。但入射光随着入射角度变大,一直接近到全反射,也就是斜入射时,表面对S和P偏振光的反射率就有所不同,斜入射光反射差法就是在斜入射条件下,检测S和P两个反射光反射率的差△p-△s值来得到表面物质的特性。

经过理论推导,我们可以得到图5中△p-△s的表达式,从表达式可以看出, △p-△s的值主要由被检测物质层的光学介电常数ε和表面层的等效厚度d来决定。被测物质由于组分和结构的不同与变化等引起的介电常数以及物理尺度在空间和时间上的细微变化,均可引起入射光s和p分量反射率的改变。因此,用OIRD可以检测和分析表面微纳尺度的物性和变化。另外,对于一般的光学检测方法来说,如在正入射条件下,其表达式是一个含有多个未知数的代数式,但OIRD方法可同时获取反射光的基频和倍频两路信号,OIRD的表达式是一个含有两个未知数的一个方程组,原则上是可以求解的,通过求解就可以得到相关的物理参数,这也是OIRD检测方法特点之一。OIRD方法不仅有很高的灵敏度,而且具有很高的空间分辨率和时间分辨率。

以生物芯片为例,相同生物分子的不同浓度具有不同的平均介电常数和等效厚度,不同的生物分子具有不同的尺度和不同的介电常数,因而可以用OIRD 区分不同的生物分子和同一种分子的不同浓度。生物分子的结合或离解,都会引起其分子尺度和介电常数的变化,因此,不仅可以用OIRD 检测生物分子反应的结果,而且可以用OIRD 监测生物分子反应的动态过程,并获得其反应动力学和热力学参数。

(讨论)

郭沁林:吕老师你这个样品,你现在是斜入射,是不是要求特别高,才能做这个实验?

吕惠宾:您说得对。因为检测的生物分子只是一个单分子层,如果浓度不是饱和浓度,单分子层都是不满的,因此对于光的稳定性和偏振性要求还是很高的。

我们首先是把OIRD方法用于探测氧化物薄膜层状外延生长的过程。图6是一个检测结果。图6的左边是所制备氧化物薄膜的高分辨透射电镜截面图,说明薄膜确实是原子分子一层一层外延生长的。右边是生长过程中探测的RHEED和OIRD信号,证明OIRD确实可以探测到氧化物分子层生长的信号。

 

图6、用OIRD和RHEED同时监测氧化物薄膜的层状外延生长

(讨论)

吴令安:你这个横坐标是时间吗?

吕惠宾:是,是时间。

生长薄薄的时候,一个分子层,一个分子层的生长,我们原位实时的监测它的生长动态过程。RHEED可以证明OIRD能监测到薄膜分子层外延生长的信号。我们生长氧化物的分子层,其厚度大约4个埃,探测光的波长是6328埃,从经典光学的角度是不可理解的,但实验证明它确实可以检测到。

检测薄膜的结果表明,4个埃厚的分子层变化1%,OIRD就可以检测到,而且可以同时获取两个路信号,表明检测的空间分辨率和灵敏度都很高的。我们把这种具有非接触、无标记、高通量特点的检测技术,并在凝聚态物理证明可行的方法,推广到生命科学里来,用来检测生物分子的相互作用及其反应动力学过程。

(讨论)

冯宝华:你那个非接触,你的样品在哪?怎么是非接触呢?

吕惠宾:一般把光照不叫“接触”,仅光照就认为是非接触。

冯宝华:你那个光打到样品上。

郭沁林:所以接触了。

桂文庄:光打到上面不算接触。

郭沁林:吕老师你说光打到样品上,你的分辨率是多少?那我要问你这个面积,大概这个光能缩小到多小?

吕惠宾:光点的大小会影响到表面探测样点的分辨率,我们现在用的光斑面积,由于是斜入射,大概是20个微米乘50微米。但我们更关心的是对生物样品的分辨率。

郭沁林:还能再小吗?

吕惠宾:这个取决于光学系统。理论上是可以的。

郭沁林:你为什么不标一个面积,而标一个深度?

吕惠宾:比如生长薄膜的时候,我们关心的是厚度的变化是多少。

郭沁林:实际上你这儿,要说成一个面积变化就很大了。

吕惠宾:我关心是它的垂直深度。平面大小可以通过光扫描来实现。

冯宝华:就是光的最小的聚焦,如果你光本身是聚不了那么小的,只是移动光斑。

吕惠宾:光斑是不移动的。比如生长材料,,假如生长了半层,或四分之一层的时候,没有把这一层占满,所以说占有率。

冯宝华:叫空间分辨率。

吕惠宾:也可以这样说。我们生长薄膜,一个分子层是4个埃,生长1%层的时候,我们就能检测到信号,说明分辨率还是很高的。

郭沁林:大家也关心面积,是不是分辨率更好一点?大家都知道,能最小探测多小一个分子团?或者什么样?

吕惠宾:不同的检测有不同的要求,对于生物来说,一般能检测一个分子层就很好了。关于检测面积的大小,最小面积取决于光斑大小,大面积可以通过扫描来实现。

图7是OIRD实验装置的照片,可以根据不同的实验和要求,选择不同的组合方式。

 

图7、OIRD实验装置

图8是OIRD的计算机控制和数据采集与处理系统,可以根据需求获取一维信息,二维信息,或三维信息。三维信息我说一下,纵坐标表示的是信号的强度,而不是样品的成像。

 

图8、OIRD的计算机系统

三、斜入射光反射差方法检测的实验结果

由于时间关系,一些具体的我就不多介绍了,主要介绍一些实验结果。

如图9所示,我们在抗原和抗体反应之前,先对芯片进行扫描检测,在抗原和抗体反应之后再对芯片进行OIRD扫描检测,然后对两个检测结果进行差值,这样就排除了由于芯片不平整等原因造成的噪声,使结果更加清晰。

 

图9、用OIRD无标记检测抗原和抗体的反应

图10是用OIRD无标记检测不同浓度蛋白质芯片的检测结果,可同时获取两路信号,灵敏度达到14fg,说明用OIRD无标记检测蛋白质芯片是可行的。

 

图10、用OIRD无标记检测不同浓度IgG蛋白芯片

图11是用OIRD无标记检测核酸特异性反应的检测结果。与荧光标记检测结果是一致的,说明用OIRD无标记检测核酸芯片是可行的。

 

图11、用OIRD无标记检测核酸芯片

图12是用OIRD无标记检测2500个样品点的抗原和抗体杂交反应。芯片上的2007-2011是兔IgG抗原样品点,背景是人IgG抗原样品点,把芯片分别与兔IgG抗体和人IgG抗体反应。左边的是芯片与兔IgG反应的结果,右边的是芯片与人IgG反应的结果。说明用OIRD无标记高通量检测生物芯片是可行的。

 

图12、无标记检测2500个样品点的抗原和抗体杂交反应

(讨论)

吴令安:一个是兔子,一个是人。

吕惠宾:是,一个对应兔IgG,一个对应人IgG。

吴令安:黑的是反应了,白的是没反应,是吗?

吕惠宾:不是。正好是反的,白的对应反应,黑的对应没反应。颜色对应检测信号的强度。

厚美瑛:这个跟芯片有什么关系?

吴令安:这就是生物芯片。

吕惠宾:这个是实际的实验检测结果,我在一个玻璃片上面点了2500个不同IgG的生物样品点,这就是一个生物芯片。

厚美瑛:刚才说分辨率有关,你一个点能点多小呢?

吕惠宾:一个点可以大概100左右。

吴令安:你一个点是一个样品,怎么固定呢?是粘住吗?

吕惠宾:是生物分子结合在芯片表面的活化层。芯片表面有制备的一层活化层,它可以跟生物分子结合。能作为活化层的材料是很有限的,因为要跟生物分子相结合才可以。

厚美瑛:你的分辨率是跟光斑大小有关,是不是?

吕惠宾:是。分辨率一个是与样品点的大小有关,多大的样品点可以探测?另一个更重要的是物样品的浓度,样品的浓度多少可以探测。

厚美瑛:你最后的分辨率是取决于什么?

吕惠宾:分辨率主要是指能探测生物样品的浓度。

冯宝华:在这个范围,我认为可以分辨。

吴令安:弄了一堆的样品,样品拿到实验室它会变吗?

吕惠宾:生物样品一般尽量在实验室制备。有些芯片是买来的或在其他实验室制备,运输过程要考虑环境和温度等因素。

下面介绍一下用OIRD监测生物分子反应的动态过程。前面说了,标记的方法只能得到最后的结果,反应没反应,但对于反应的动态过程,标记的办法是没办法测的。只有得到反应的动态曲线,才能够得到它们的结合力。

图13是采用流体腔,用OIRD原位实时监测生物分子反应动态过程示意图。

图13、用OIRD原位实时监测生物分子反应动态过程示意图

图14是用OIRD原位实时监测人和兔IgG抗原芯片和兔IgG抗体反应得到的反应动态过程曲线。曲线还是相当漂亮的,因为它是从几十个微米尺度的单分子层得到的反应曲线。我们知道,通过这些曲线,就可以得到其反应动力学参数。对生命科学来说,这非常需求的。

 

图14、用OIRD原位实时监测抗原和抗体的反应动态过程

我最后再介绍一个例子。从我们这儿毕业的一个学生,现在在复旦大学,她和复旦相关研究人员合作,他们用OIRD方法在药物筛选方面取得了突破性的进展。

如图15所示,这个团队假设一种化合物可以令突变的亨廷顿蛋白被吞噬,增强清理效果。他们做了小分子筛选来找出这样的化合物,最终发现4种化合物能改善亨廷顿舞蹈病患者的病情。而其他涉及多聚谷氨酰胺扩展的疾病,也可能用这种方法打开突破口。此论文被评为2019年Nature 十大杰出论文之一。

 

图15、OIRD用于药物筛选取得突破进展

如图16和17所示,用OIRD一次看获取500个生物样品点的反应动力学曲线;一次可无标记检测上万个样品点的生物芯片。

 

图16、用OIRD一次可同时获取500样品点的反应动力学曲线

 

图17、用OIRD一次无标记检测上万样品点的生物芯片

如图18所示,在表中我们对几种代表性高通量检测生物芯片方法进行一个比较,从表中可以看出,OIRD方法是目前无标记高通量检测生物芯片的最好方法之一。

 

图18、几种高通量检测生物芯片方法的比较

从上面的介绍我们可以看出,OIRD方法已经成为非接触、无标记和高通量检测生物芯片及其反应动力学过程的最好的方法之一。OIRD在研究生物分子相互作用方面具有潜在和广阔的应用前景。如在基础研究方面,研究生物分子的特性、生物分子的相互作用及其反应动力学过程,包括DNA-DNA、蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA。在开发应用方面,如药物分析、药物筛选、细胞检测、疾病诊断和环境等。

我们希望能把物质科学研究方面的技术带到生命科学复杂的体系,通过学科交叉在相关研究方面能够取得一些突破和进展。

这里感谢我们所有的合作者。也感谢中科院、科技部和基金委等部门支持和资助。

谢谢大家!

(讨论)

桂文庄:你现在的方法有没有做成仪器?

吕惠宾:这也是我们遗憾的一点,因为这个项目也是我退休以前做的最后一个项目,主要的专利权都在物理所,有六项发明专利。国内外主要就是我们所和国外的加州大学戴维斯分校,但主要的专利是我们的。在我退休前,申请过基金委的仪器项目,由于合作单位的一个人超项,被砍掉了。我在美国霍普金斯大学的时候,有几个教授在波多黎各的公司,还请我到那去一趟,就是说希望我们做了设备以后,让他们做我们仪器在美国的代理人。

桂文庄:哪一年做出来的?

吕惠宾:实际上在2014年左右就出来了。

桂文庄:2002年、2003年的时候,甚至还早一点,成都光电所就在做生物芯片,我们局当时还支持了他们的项目。他们是做机器的,光学非常强,如果你这个项目,当时能够跟局里沟通一下,我们的光机所完全没有问题,有点可惜。

吕惠宾:这个从荧光扫描仪有不少可借鉴的,包括样品的扫描,后边数据的处理,有好多跟荧光扫描仪很类似。

桂文庄:咱们中科院在苏州搞了一个医工所,是专门做医疗仪器的,可以跟他们联系一下。

吕惠宾:后面寄希望于学生,我已经退休了。

桂文庄:我再问一下,现在核酸检测假阴性的问题大家都比较担心,你对这个问题怎么看?

吕惠宾:这个我是外行,我也很想知道核酸检测到底是什么核酸?或者是核酸的什么特性?核酸有109种,那么多种,它一定检测的是某一种,或者某几种,或者是某种的什么特性,这个我实在一点不懂。

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【邀请报告】

 

郭红莲:光镊及其在生命科学中的应用

各位领导、各位老师大家上午好,来这儿做这个报告真的特别高兴,我是从这毕业的,也在这工作了很长时间,在座的都是我的前辈,非常亲切,跟回家一样。

我讲的不局限于生物应用,在开始做光镊的时候主要想做生物,后来发现做生物还是比较难,也做了一些纳米颗粒材料等方面的工作。所以我从光镊的背景,发展的历史,以及应用,包括一些生物方面的,材料方面的,都给大家汇报一下。

主要从历史背景、原理、方式和应用这四个方面讲一下。

光压的历史背景特别早,从17世纪初德国的天文学家开普勒就发现慧尾背着太阳。1873年的麦克斯韦电磁学理论,这组方程就可以理论上算出辐射压到底有多大。

如图1所示,1909年德拜从线偏振平面电磁波作用于球形例子的辐射压理论。那光不但具有能量,还具有动量,所以它跟物质交换动量的时候,就是动量对时间的导速,这就是所谓的光的力学效应。

 

图1、德拜线偏振平面电磁波作用于球形粒子的辐射压力理论

在激光发明之前,我们感觉不到光压的存在,因为单个光子的动量非常小,比如太阳照得非常强的时候,它的压强也就是1达因每平方米,只是大气压的百亿分之一,所以根本感觉不到,测量也是不可能的。我们尽管知道有它存在,但不可能测出来。

直到上世纪60年代激光的发明,休斯实验室的梅曼等作出第一台激光器,1970年贝尔实验室的亚瑟·阿斯金(Arthur Ashkin),获得了2018年诺贝尔奖,开始研究光压,如图2所示,用1W的Ar+激光器,实现了二维囚禁,用了两束光对打,实现了三维囚禁。

 

图2、Ashkin用Ar+激光器实现二维囚禁和三维囚禁

如图3所示,1978年Ashkin实现了原子冷却和囚禁。

 

图3、1978年Ashkin实现了原子冷却和囚禁

如图4所示,1986年Ashkin建立了三维势阱。

 

图4所示,1986年Ashkin建立了三维势阱

光镊,是Ashkin在1986年提出的,如图5所示,主要是靠光的梯度力,形成一个光学势肼,捕获和操纵微小颗粒。光镊不仅可以操控,也可以测量纳米量级的位移和平移,这些正好和生物大分子产生的一些力及量级基本相当,所以在生物领域,起初用的最多的就在这方面,当然现在用得范围越来越广了,如在物理、生物化学交叉学科都有用。这也跟刚才吕老师讲的一样,无直接接触、无入侵式损伤,我们用镊子之类的东西,还是多多少少有损伤,比如镊子有接触,总会粘一些东西上去,不像光,没什么影响。对于热损伤,我们可以挑选波长,尽可能让它对生物分子是不吸收的,所以一般叫无直接接触,无入侵式损伤。

 

图5、光镊的基本原理(1)

我们通常用一束平行光,经过一个透镜,高度汇聚,一般是要充满这个物体。光打到小球上有折射反射,然后光和粒子有一个动量交换。如图6所示,光镊能做到三维捕获,有一个条件,就是梯度力必须大于散射力。对于金属的小球一般用纳米尺度的,你要到微米可能就不行,吸收太大。

 

图6、光镊的基本原理(2)

(讨论)

左战春:这里不考虑物理的浮力、重力值吗?

郭红莲:因为小球非常小,所以一般不考虑。如果是大了,可能需要考虑重力之类的,一般小的都可以忽略。

刚才谈的是操控,我们也经常用光镊测量生物分子的一些力学性质。比如马达蛋白,我们想知道它的详细的动力学机制,我们不仅要操控它,还要测量它的力。如图7所示,无论理论上还是实验上,都证明这个光阱类似于一个弹簧,你只要粒子偏离了它的平衡点,这个光阱会对它产生恢复力,这个恢复力就是F等于KtrapX。

 

图7、光镊的基本原理(3)

小球如果被一个生物分子拉得偏了光阱中心,它到底受了多大的力?我们怎么测?先测它的位移,我们知道它的中心在哪,然后看小球偏离了多少的位移,根据事先标定的系数,就可以得出力的大小。

图8是双光镊的结构示意图。比如做一些生物的DNA的拉伸性质,两头都拉。双光镊就很简单,我们把一束激光分成两束,就形成两个光阱,能捕获到两个粒子。这个红色的光,就是形成的光阱,另一个我们还需要探测,测它的位移,一般还需要一个探测的光,黄色的就是那个探测光,一般我们选用未知敏感探测器,得到它偏移的信息。

 

图8、双光镊结构示意图

图9是一个双光镊的实验装置。

 

图9、双光镊的实验装置

(讨论)

左战春:这个光阱的光分两束,是相互干涉的吗?

郭红莲:不干涉,就是为了独立操控。

吴令安:你这是个什么探测器?

郭红莲:不是CCD,叫未知敏感,类似于四象限探测器,但比四象限探测器更好用一些。我们也用过CCD,远不如这个快。

图10显示了不同的光镊。不同的用途,有不同的种类,比如最简单的就是单光束的,也有双光束对打的,因为光镊最薄弱的环节还是捕获力,为了捕获得牢一些,现在也有用对打的。还有做光喷泉的。最近还有靠表面的等离子效应做离样品表面很近的一层纳米光镊,就是捕获得粒子会更小一些。

 

图10、不同类型光镊

下面就看一些光镊技术的应用。刚开始是用来操控,图11是用一个单光镊,捕获了一个酵母细胞,想移到哪就移到哪,这是光镊最简单的功能。仅移动光就行。

 

图11、用单光镊捕获及移动酵母细胞

图12是用双光镊俘获精子。

 

图12、双光镊俘获精子

(讨论)

郭沁林:实际应用当中,怎么一镊一抓?

郭红莲:就是控浓度。

郭沁林:怎么知道抓一个还是抓两个?

郭红莲:就是经验嘛。

郭沁林:怎么判断?

郭红莲:能看得出来,看得见。这是捕获精子,你看这个图成像,有多大的浓度可以看见的,控制浓度就好了。

图13是用光镊测量细胞膜力学特性。用两个小球做这个实验,一个是用光阱能抓着的力,另一个是有一个球能贴到底上拉着玻璃来变的。做细胞膜测量,比如说它表面弹性膜量的测量,测量的意义,比如说它有些疾病,得了镰刀贫血症,它的膜弹性和正常的不一样,可以用力学标定一下正常的和病变的不同。

 

Acta Mater. 2004(52): 1837–1845

图13、细胞膜力学特性测量

图14是用光镊分时共享操控多个小球。

 

图14、分时共享操控多个小球

图15是用双光镊测量生物分子马达力学特性。比如说Kinesin就是马达蛋白,在细胞里负责运输能量的就是马达蛋白,它在微观上走,负责把我们的能量运输到它想去的地方。

 

图15、生物分子马达力学特性测量——Kinesin

马达蛋白被包到一个小球上,我就可以看它到底是怎么走的,我们发现马达蛋白也跟人的脚一样,两只脚一步一步的迈,一步是八纳米。也可以通过加了多大的力就走不动了,能知道其负载有多大。

另外一种,myosin也是马达蛋白,我们的胳膊、肌肉收缩的时候都会用到的这个马达蛋白,比如说你想搬胳膊什么都很自如,其实这都是马达蛋白的协同作用。如图16所示,我们研究它到底是怎么干活的?看它的步幅,研究它有多大的负载,都可以测量。

 

图16、生物分子马达力学特性测量——Myosin

前面讲的都属于比较体外的大分子水平的,如图17所示,光镊应用到了载体,一只活的小鼠,这个是它的血管,能看见有红细胞在跑,我们能把红细胞捕获。光穿过肉体还是有难度的,光进去会散射。这个做的是在小鼠的表皮。如果能在体内做的话,对血栓等,用光干预一下是可以去掉,这个还是比较接近于应用的一个工作。

 

图17、用光镊对活体动物中红细胞进行操控

(讨论)

吴令安:这个光怎么透过血管呢?

郭红莲:耳朵很薄,通过表皮,光纤导进去。

下面介绍光镊在材料领域应用的例子,图18、19和20是和(陈科)老师他们合作用光镊操控Janus粒子,相关工作在比如药物载体、电子器件等方面可能有应用。

我们先把聚苯乙烯小球,给它半个表面包了几纳米的一层,发现它在光阱里就不是这么均匀的捕获,它就可以转动了,可以控制它顺时针、逆时针转,转的速度也是可控的。因为这个颗粒是三微米的大小,也就是说我们在相当于微尺度实现的一个小马达,你想做一个旋转的马达,用这个是可行的。

(讨论)

左战春:它怎么转的?

郭红莲:由于它不对称嘛。

左战春:不是光的原因?是它自己?

郭红莲:得靠光操控。

郭红莲:当时做这个就是想能够控制这个粒子,想让它运动到哪它就运动到哪。

 

图18、Janus 粒子在点光阱中的可控旋转

 

图19、Janus 粒子在线光阱中的可控运动

 

图20、Janus 粒子在环形光阱中的可控运动

刚开始是点光阱实现旋转。我们又做了线光阱,虽然这个光看不见,但知道那儿产生一条线状光阱,在光阱的范围它会转,它有一个包茎的半面和聚苯乙烯的半面,到了光的末端还会自己矫正调整和拐弯,这边就是我们做的聚苯乙烯没包茎的,形成这个线光阱是一样的,它就不动,到了线光阱就排好了,这个是包了一半,它可以在里边走。

因为想实现任意路径,我们又做了环形光阱,这个Janus可以在这个环上,控制它是顺时针还是逆时针转,也是聚苯乙烯的,整个一圈都捕获了它,捕获一个、进去一个,就这么一个圈,然后Janus粒子就会动。

其实这几个就想展示,实现任意路径的移动,你想做一个圆形的,做一个圆形光,你想做一个方形的,就做一个方形光。

(讨论)

厚美瑛:是什么让它做线性或者环形?是光的梯度?

郭红莲:对。

厚美瑛:这个装置并没有任何不同,就是把光梯度了。

郭红莲:对,装置还是那个装置,比如说我原来用的球透镜,现在是了柱透镜。

左战春:这个光阱主要是改光强?梯度变化?或者是其它比如说从原点变成线点光?梯度变化了,有没有影响?

郭红莲:有的粒子不敏感,它没啥影响。

周长柱:主要还是对光强,梯度。

郭红莲:光镊是很有前途的一个工具,有一个同事也是做光镊的,现在跟一个公司合作。临床上,镜子筛选,人工辅助生殖,在图象上看到精子跑得好的可以捕获下来,就挑出来,就比现在的能做的更好一些。另外,一个活体生物,光到了生物体内是散射的,现在有一些技术,把散射的光做时间反演,让它在生物体聚焦。还是有临床应用前景的。

那我今天的报告就介绍这么多,谢谢大家。

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【讨论】

冯宝华:你控制粒子用的激光,对光是有要求的,如果你这个光不稳定了,或者其它什么,粒子就跑掉了?

郭红莲:还是光学试验的要求,在光学平台上,如不能推平台。

冯宝华:我看有时候重力控制它跑掉了,象这个光有没有问题?

郭红莲:光源一般没问题。其实那个光点的捕获力非常小,就是另外来了一个粒子撞它一下,原来那个就有可能跑。

吴令安:以前有个环形望远镜激光器,我看有个灰尘捕获了,不动,几分钟,那儿不是焦点,它就是在激光器的某一个位置,一动不动。

郭红莲:捕获了。

吴令安:因为它散射嘛,发光,很亮很亮,不是焦点,这是什么原理?

左战春:那就是光照射到了灰尘,散射。

郭红莲:按说不应该啊。因为梯度力,那个还是不够的呀。

吴令安:我不知道是不是两个,你说的达到平衡,它有一个散射力。

郭红莲:梯度力,能算出来那个梯度力。

吴令安:很奇怪,不是焦点。

厚美瑛:所以就不是。你发现了新现象。

郭沁林:你最后那张片子挺有意思,但我想不通有件事,比如说优选精子的图片,如果它有时候动得快,有时候动得慢,实际操作,光一照都捕获了,还是一个一个去检?

郭红莲:郭先是一个大范围,比如有一个很大的成像范围,可以跟踪哪个跑得快,我看过,可以看到那个是头,长得乱七八糟的就是不好的。

郭沁林:一个上午,一个工作人员能选多少个人?怎么弄?

郭红莲:很快。比如实验区是200微米×200微米,那就有大量的精子,看哪个跑得快,眼睛也可以看到哪个长得好,立马就捕获了。

郭沁林:就是效率低呀。

郭红莲:这个不需要很多,做辅助生殖的不需要很多。

郭沁林:我明白了,我以为要选很多。

郭红莲:不需要。

郭沁林:就像试管婴儿一样的。

郭红莲:对。不需要挑很多。

冯宝华:活的细胞,可以保持多长时间?

郭红莲:挺长的。

冯宝华:我的意思是细胞在你实验期间能保持多长时间的活性?

郭红莲:只要活性液给它提供得足够,其实时间还是比较长的。

冯宝华:你做实验没问题,好像20分钟就不能做了,细胞就不行了。

吕惠宾:如果从活性液中拉出来,在自然环境下不行。

郭沁林:变质了。

郭红莲:生物活性肯定要处理好嘛。其实我们条件还是比较好。

郭沁林:在显微镜下可以看到哪个跑得快,用吸管一吸不就完了嘛?

郭红莲:吸管吸不着一个呀。吸管太大了,吸管吸的可不是看到的那一个。

郭沁林:我看到能够吸,我看过一个纪录片。

郭红莲:那也是微吸管,在显微镜下,用吸管,可能有所谓的机械损伤。但光镊是光,没损伤。

郭沁林:也许几十年后说光也对它有损失。

冯宝华:你的实验和保存可能还不太一样。

郭红莲:做实验,当然需要符合你的样品,但这个可以商量好,你保存的条件也可以给我做一下。

吴令安:时间关系,沙龙活动到此结束。谢谢两位老师,感谢院老科协领导和到场的各位专家!

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