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再生医学关键技术及临床转化研究

主办单位: 中国科学院老科协
承办单位:中国科学院老科协遗传发育所分会、遗传发育所离退休工作部
举办时间:2019-07-18       【字号: 访问量:

目录

简介
主持人致辞
主旨报告
邀请报告
讨论与交流
主要专家简介:
  1.                安锡培(主持人): 中科院遗传发育所,中科院老科协遗传发育所分会秘书长
  2.                陈  冰(主旨报告):中国科学院遗传发育所副研究员,主要从事再生医学领域组织损伤修复的基础及转化研究工作,先后承担国家863课题、国家重点研发计划课题及中科院先导专项课题等。
  3.                王  霞(邀请报告):清华大学特别研究员,主要从事成体干细胞和人类疾病的相关研究。
  4. (以下按姓氏笔画排列)
  5.                王  远  中科院动物研究所,人事处副处长
  6.                王  霞  清华大学药学院,特别研究员
  7.                王东江  中科院遗传发育所,高级工程师、分会会员
  8.                刘  敏  中科院遗传发育所,研究员、分会会员
  9.                汤火顺  中科院遗传发育所,副研究员,分会会员
  10.                孙庆庆  中科院遗传发育所离退休工作部,主管
  11.                孙勇如  中科院遗传发育所,研究员、分会会员
  12.                李文彬  中科院遗传发育所,研究员、分会会员
  13.                李亚南  中科院老科协,办公室主任助理
  14.                肖志峰  中科院遗传发育所,副研究员
  15.                何凤琴  中科院动物所,副研究员
  16.                何远光  中科院老科协,执行理事长兼秘书长
  17.                宋秋生  中科院遗传发育所遗传发育所,分会理事长
  18.                张  颖  中科院遗传发育所,研究员
  19.                张志林  中科院老科协,顾问
  20.                张相岐  中科院遗传发育所,研究员、分会会员
  21.                金振华  中科院遗传发育所,研究员、分会会员
  22.                郑瑞珍  中科院遗传发育所,研究员
  23.                赵世民  中科院遗传发育所,副研究员、分会会员
  24.                姜亚东  中科院地理所,离退办主任
  25.                祝  诚  中科院动物所,研究员
  26.                桂文庄  中科院老科协,副理事长、研究员
  27.                翁曼丽  中科院遗传发育所,研究员、分会会员
  28.                黄玉萍  中科院遗传发育所离退休工作部,部长
  29.                麻莉雯  中科院老科协,办公室主任、高级工程师
  30.                彭丽玲  中科院老干部局,局级
  31.                景建康  中科院遗传发育所高级工程师,分会理事
  32.                魏荣瑄  中科院遗传发育所,研究员、分会会员
展开

【简介】

 

组织、器官的功能障碍或丧失严重危害人类健康。如何从根本上解决这一难题,已成为生命科学领域积极探索的前沿课题。目前组织或器官移植是治疗组织/器官缺损的主要手段,但怎样获得可供移植的组织或器官是当前临床治疗所面临的主要问题。近年来,再生医学组织器官构建技术的发展开创了人造组织器官的新局面,从某种意义上讲,它已成为一个国家医学发展水平的标志之一。 再生医学是多学科交叉的新兴学科,其发展必将带动整个医药生物领域及其产业的发展,具有重要的战略意义。本期学术沙龙对再生医学的关键技术及其实现路径、未来发展趋势及其面临的难点和伦理问题展开了热烈的讨论,为再生医学的未来发展进行了展望。 

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【主持人致辞】

 

安锡培:中科院老科协领导、与会专家学者,大家上午好!很荣幸老科协遗传发育所分会成立以来于2014年开始承办学术沙龙,这是第六次了。在院领导、院老科协领导下学术沙龙做的都很不错,相继承办了干细胞、防御素和再生医学等三期科学技术前沿学术沙龙,还承办了中国科协的表观遗传学、基因组编辑等新观点新学说学术沙龙,反响都不错。今天是中国科学院老科协主办的一期学术沙龙,邀请遗传发育所陈冰老师和清华大学王霞老师作为主讲,介绍再生医学的一些关键技术和临床转化研究方面的工作。再生医学研究是前沿学科,发展迅速,现在已取得了一些成果,具体我不多讲,下面听两位老师的报告。

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【主旨报告】

 

陈冰:再生医学关键技术及临床转化研究

各位老师上午好,我是来自中科院遗传发育所戴建武再生医学研究团队的陈冰。特别感谢老科协给我们这个机会,介绍我们在再生医学方面做的工作。我们今天的汇报主题是“再生医学关键技术和临床转化研究”,也借此机会希望能够得到各位老专家对我们工作的指导,把我们的工作做的更好。

组织器官再生是人类一直以来的梦想,在神话传说、文学作品和科幻小说中对器官组织再生都有很多美好的描述。自然界中也有很多动物有组织器官再生的现象。再生医学是既古老又年轻的学科,在过去的几千年来受基础研究和技术发展的限制,没有发展成一个独立的学科。再生医学的概念是利用生物支架材料、干细胞和再生因子这些关键技术在体内引导组织器官的再生或体外构建有功能的器官(图1),目的是通过组织器官的再生或者制造来替代人体受损的组织和器官。再生医学学科的形成,标志着人类社会步入了组织器官再生的新时代,也为人类面临的许多医学的难题带来了新的希望。

目前我国因各种疾病造成的组织器官缺陷或者是功能障碍位居世界之首,每年有100到150万人需要器官移植,真正实施手术的只有一万人左右,供需比非常低。现有的供体器官远远不能满足这个领域的需求,所以这也提出了再生领域组织器官再生方面的需求。再生医学产业前景非常可观。可以说再生医学是继资源型、信息型经济之后一个新的经济发展引擎。目前这个学科还比较年轻,我国在这个领域和发达国家的差距比较小。但是我国再生医学产业目前还是存在一些问题,科技成果的转化能力非常低,90%的成果仍然在实验室里,技术高端产品主要依赖于进口,这主要是因为没有形成完整的产业链,缺乏产业化接轨的机制。我们的工作首先要在实验室里面进行一些研究,发展新的技术能够解决组织器官再生的问题,进一步希望能够在产品转化过程中有一些尝试,使实验室的技术最终能够应用于临床。

图1. 再生医学的概念及其三个要素

再生医学有三个要素(图1)。首先是干细胞,干细胞领域这些年非常热,它是第三次医学革命的核心,这个领域的研究成果多次获得诺贝尔奖。我们在再生医学领域需要解决如何使这些干细胞发挥其应有的作用;第二个要素是生物材料,它的种类非常多,从发展方面最早有生物惰性材料、之后有生物活性和可降解的材料,从材料性质和生物来源也有很多的分类。能够用于组织器官再生修复的材料首先要具有生物功能性,同时还需要有良好的生物相容性;从产业化角度考虑又需要有可加工性、可以成型、可以被消毒、要有化学稳定性。我们的工作主要集中在胶原类生物材料。胶原具有很好的生物相容性和可降解性,具有适合细胞生长的孔径、有很好的细胞界面关系,目前利用胶原生物材料已经在很多学科中有所应用。第三个要素是再生因子,它是人体广泛存在的多肽类大分子,可以与细胞膜受体结合来调控微环境。从产业化角度考虑,生长因子要能够制备,现在技术手段上也是能够实现的。通过基因工程技术可以构建生长因子表达载体,将它们转化到工程细胞中进行发酵表达并进行纯化,最后得到有活性的因子应用在组织器官再生的修复中。

为什么说这三个要素是再生医学三要素呢?我们分析一下组织的微环境。人体组织是由相互作用的细胞、细胞外基质、再生信号组成的,干细胞是微环境中的功能单元,支架材料相当于细胞外基质,再生因子相当于再生信号分子。再生医学就是希望通过这三个要素的有机结合,能够构建组织器官再生的微环境,通过生物材料表面功能化的修饰、调整干细胞和再生信号分子空间分布达到这样的目的。

过去十几年,我们发展了两个再生医学关键技术。一是胶原特异结合生长因子技术:天然结构的生长因子加载在胶原材料上,只是比较简单的物理吸附,在液体环境下很容易扩散到支架材料以外的组织中;比如1微克可以达到活性作用的因子,但是有0.5微克都扩散走了,这样就可能达不到预期的效果,而扩散走的因子对周围不需要的地方也会产生副作用。我们通过基因修饰技术,在生长因子N端或C端融合胶原结合肽,使之与胶原支架材料形成特异性的结合就避免了扩散。

第二个技术是支架材料特异结合干细胞技术:如果把细胞简单加载在支架材料上也存在容易扩散的问题。我们通过干细胞表面识别分子来修饰支架材料,把分子交联在支架材料上,当细胞再加进去的时候,通过细胞表面的识别作用就可以使细胞较牢固的结合在材料上,这样就减少了其扩散。这个技术系统解决了干细胞精准利用和空间定位的问题。

通过以上两个主要技术,我们在动物模型中探索了多种组织的再生。举两个例子,一是在子宫内膜修复方面所做的工作。孕育生命有两个要素,精子和卵子相当于种子,子宫相当于土壤,这两个要素缺一不可。1978年试管婴儿技术解决了部分受精障碍造成的不孕,而子宫内膜再生是我们想要解决的问题。我们首先在动物模型中进行了探索,结合间充质干细胞或再生因子的功能生物材料植入到大鼠和猪受损的子宫部位实现了大鼠和猪子宫内膜全层缺损再生,显著提升了妊娠率。在动物实验基础上,在2013年我们与南京鼓楼医院合作,开展了子宫内膜再生的临床研究。

第一例子宫内膜再生婴儿于2014年7月在南京鼓楼医院诞生(图2)。目前临床实验还在持续进行中,现在这个项目已经实现企业转化。

图2. 第一例子宫内膜再生婴儿

第二个工作,我想介绍一下脊髓损伤方面的工作。脊髓损伤以后是严重致残的,我国有200多万患者,这些人中主要是年轻人,给家庭和社会都带来了很大的负担。脊髓损伤的修复一直是最具挑战的医学难题,从三千多年前一直现在,脊髓损伤的临床治疗手段都非常有限。现在治疗方案很大程度上仍然停留在阻止损伤进一步扩大或者是训练病人在脊髓损伤后应付产生的各种生理残疾和障碍,有效的治疗方法是很少的。为什么脊髓损伤治疗这么难呢?在许多其他类型的损伤中,比如骨和皮肤,组织损伤后损伤区会产生有利于再生的微环境,所以会有一定程度的自发修复。而脊髓损伤之后有一系列动态变化过程,经过原发损伤和一系列继发损伤最终会形成不利于神经再生的微环境(图3),这个微环境会阻止和抑制神经纤维的再生。我们的策略就是要克服这个抑制性的微环境,重建有利于神经再生的微环境。

图3. 脊髓损伤后形成不利于神经再生的微环境

首先根据脊髓神经的结构特点,我们制备了有序胶原材料,也研制了胶原材料特异结合的多种神经再生因子,它们和胶原的结合能力是比较强的。对材料评价过程中要用到动物模型,常见的脊髓损伤动物模型有部分性损伤的。而为了更加客观评价支架材料的功能,我们主要是采取全横断损伤模型,这种模型是神经再生的金标准,我们后期都采用了这种模型。我们在大鼠和比格犬脊髓损伤中进行了尝试,证实了功能生物材料可以促进神经功能的再生和动物运动功能的恢复。 我们也进一步探索了脊髓再生修复的机制。目前比较公认的脊髓损伤再生的机制,一是皮质脊髓素的再生,二是神经元的发生和神经的接力,还有人认为这两种因素都有。我们发现大鼠和比格犬中,损伤后进行功能修复,皮质脊髓素是无法穿越损伤区的,目前我们认为脊髓损伤再生的修复机制,首先是损伤激活内源神经干细胞向损伤部位的迁移,然后分化为功能神经元形成神经桥接。

在以上研究的基础上,我们将脊髓损伤修复进一步推进到临床研究中。临床研究应用的细胞主要包括神经干细胞、间充质干细胞、嗅鞘细胞等。神经干细胞是神经修复的理想细胞,目前单纯移植细胞临床效果并不理想。我们在2015年开展了国际上第一个神经再生胶原支架修复陈旧性完全性脊髓损伤的临床研究(图4)。目前入组的患者已完成初步有效性评价,大部分患者植物神经功能上有改善,部分患者神经传导和运动功能有所改善,并且出现了反射性小便的感觉。我们还开展了急性全横段脊髓损伤修复的临床研究,在病例入组方面建立了严格的急性完全性脊髓损伤判定标准,在一些患者中取得比较好的效果,目前也还在进一步进行临床随访和观察。

图4. 国际上第一个神经再生胶原支架修复陈旧性完全性脊髓损伤临床研究

这些研究也产生了一些影响,也得到的国际同行的认可,戴老师也受邀在一些再生医学国际性会议上做了报告,一些杂志也对我们的研究进行了报告。同时,我们也在其他组织损伤修复方面陆续开展了一些研究,与临床医院有紧密的合作,也有一些成果入选了中科院改革开放40年标志性成果和国家博物馆的展览(图5)。

图5. 中科院改革开放四十年成果展

在戴老师的带领下,我们组建了30人左右的再生医学研究团队,今天也邀请了团队骨干肖志峰老师一起来,他在技术研究、临床研究推动过程中做了很多工作。同时今天的第二位报告人,王霞教授也是我们实验室毕业的,后来在美国做了博士后研究,现在在清华做教授。

再生医学可以说是一个交叉学科,需要多方面合作。那我们有紧密合作的临床团队,同时因为要做产品要做标准化研究,合作团队还有中检院的专家。我们得到了中科院先导专项和重点部署项目大力的支持,如果没有这样的项目我们是无法完成这样的工作的。一期先导的时候有王局和祝老师、陈老师、马老师等老专家陪着我们一路走来,给了我们很多的指导和支持,在项目转化过程中,有很多工作也是探索性的,我们研究所也给了我们很大的支持,非常感谢!

我们相信再生医学的明天是美好的,可以将人体所有组织器官都实现再生,谢谢大家!

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【邀请报告】

 

王霞: 成体干细胞体外培养和三维分化创新技术及其应用

非常高兴有机会回到我的母校,向各位尊敬的领导、前辈、老师们来介绍我的工作,我的工作跟戴老师整个团队这么具有重大社会意义的研究成果相比来说,我做的研究比较偏向基础。我从另外一个角度来讲一些不一样的东西,也是交流的机会。大家有需要我进一步解释的地方也可以随时打断我,我也会和大家做进一步的解释。

我是戴老师第三届博士生,出国做的干细胞领域的工作,现在回到清华大学也继续做这方面的工作。大家知道,干细胞分两大类,胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞就是精子和卵子发育到囊胚期的内细胞团在体外培养获得的具有多能性的干细胞,这一堆干细胞可以分化成身体的各种细胞类型,包括肌肉、肾脏、肝、皮肤等等,所以是全能型的干细胞。今天讲讲成体干细胞,每个器官、每个组织里边,是有其特定的干细胞,成体干细胞只能分化成器官组织里边的那几种细胞类型,这是成体干细胞和胚胎干细胞的区别。

成体干细胞是伴随我们终身存在的,研究较多的是典型的肠道干细胞。因为大家吃的食物有磨损,肠上皮细胞发生死亡,这些细胞死亡了以后需要有新的细胞来替代。这时候人肠道干细胞通过自我的更新、增值、分化成肠上皮的所有功能细胞类型。人体从胎儿阶段一直到老年整个生命过程中成体干细胞不停的发挥着功能。肠上皮主要有四种功能细胞类型(图6),都由肠干细胞分化而成,比如有吸收细胞,吃如的食物营养物质要靠吸收细胞进行吸收;还有杯状细胞,它们能分泌黏液起到润滑和屏障防御的作用,形成厚厚的黏液层,可以阻碍并杀死细菌;神经内分泌细胞,可以是分泌类似于激素物质,影响我们的食欲和情绪,还有潘氏细胞也可以分泌一些肽,具有杀菌作用,潘氏细胞还可以分泌一些肠干细胞需要的细胞因子。

图6. 肠干细胞的功能

肠道分小肠、大肠。肠壁上有绒毛,凸起的绒毛可以增加肠道吸收的表面积。肠干细胞位于肠道隐窝部位,如图6。一个干细胞分化的时候可以快速的增值成上百个细胞,这上百个细胞再进一步分化成各种功能细胞,这样人体就不需要大量的肠干细胞,少量的成体干细胞就可以维持肠道正常的结构和功能,保持一个动态的平衡。

这么多年我们知道干细胞在体内的存在和功能,为了进一步深入研究,就需要将干细胞在体外培养出来。成体干细胞体外培养技术也是一直到2009年才突破,胚胎干细胞是1998年就建立起来了,但是成体的肠道干细胞是2009年才建立起来的所谓的类器官的技术。类器官在显微镜下长成三维的球状结构。干细胞镶嵌在这些分化的细胞中,它的生长也由干细胞来维持的,类器官中由干细胞分化而成的上皮细胞,所以形成了一个腔,类似于肠腔,类器官就是像一个很小的器官组织。这里面有个概念上的混淆,整个肠道作为一个器官是分为很多组织的,有浆膜层、肌肉层、结缔组织、上皮层。肠道的吸收功能和屏障防御功能主要靠的是上皮层,肠道的多重疾病都是发生在上皮层。这个技术主要是培养的上皮层的细胞,并不包括肌肉、血管等细胞组织。

类器官长出来以后也有几种主要的细胞类型。这个技术从2009年培育肠道类器官以来,之后应用到肺、大肠、胃、肝脏、输卵管、胰腺等组织的类器官,对生物学领域的研究也做出了很大的贡献。此外,胚胎干细胞可以分化成人体各种细胞类型,从胚胎干细胞进行定向分化,后期分化到特定组织细胞时也可以用类器官来培养维持,类器官的技术这几年应用的非常广泛也非常有价值。

我开发的一个新技术,就是体外培养肠道干细胞,可以把非常纯的干细胞培养出来,在体外又可以把肠干细胞分化成为肠道三维上皮组织。跟类器官相比,类器官里边既有干细胞又有分化的细胞,是混合在一起的结构。我的技术最大的不同是把非常纯的干细胞单独的培养出来,在研究干细胞的生物学特点、遗传特点、机制方面非常方便。肠干细胞在体外获得的三维、立体的上皮组织跟体内的真正的肠道的组织相比,在形态上是高度一致的。

这个技术来源于一位哈佛的教授Howard Green,他们用小鼠成纤维细胞作为饲养层,把皮肤的干细胞种在上面,一个干细胞分裂成两个,两个变成四个,最后增殖为好几百个干细胞,最后形成了干细胞克隆。用这个技术第一次将干细胞用到了烧伤病人的临床治疗上。在体外把细胞长成融合的一片皮肤,移植给烧伤病人,开展了世界上首例干细胞移植的实验,也获得了很好的效果。这个技术也可以培养皮肤的乳腺、前列腺、肺和眼角膜的上皮干细胞。这个技术只能培育鳞状上皮干细胞, 但是所有的柱状上皮,如肠、胃、肝脏里的上皮干细胞无法培养。我的工作基于该技术进行了优化,添加了很多干细胞自我更新所需的生长因子,是需要一些环境因子一些信号来维持的,在体外模拟体内干细胞所需的信号分子从而使体外培养的干细胞也可以不停的自我更新。

如图7所示,一个干细胞可以长成一个克隆,把这个克隆挑出来进行扩大培养,获得单个干细胞来源的干细胞系,进一步说明干细胞的自我更新能力和多向分化潜能。除此以外,我们还创建了气、液界面的分化体系,肠腔是中空气态的,干细胞生长在血液类似液态的环境里,我们模拟物理上的气液界面,把干细胞长在小室中,营养因子可以通透,等干细胞长成融合的一层之后,我们把小室里面的培养基去掉,只保留外面的培养基,这样就形成了气液界面,这样干细胞就会自发的分化成为三维的组织结构。

如图7所示的一个干细胞克隆的生长过程,一个干细胞生长了三天以后形成了很小的克隆,到第11天可以生长为包含几百个干细胞的克隆。这些克隆是不是肠道干细胞呢?首先用一些蛋白的标志物来证明它是干细胞。真正肠道组织中干细胞位于隐窝的位置,Sox9作为隐窝的标志物,在干细胞中也有相应表达,干细胞也表达肠上皮的标志物,表明定位是对的。几种功能细胞类型,如肠内分泌细胞和杯状细胞和吸收细胞的标志物在干细胞中检测不到,表明它们是未分化的状态。评价干细胞最重要的是其多向分化潜能。由一个干细胞可以分化成肠道长皮的各种细胞,可以说明它就是干细胞。我们把分化成的组织做了切片,蛋白标志物染色结果表明它们确实是可以分化成肠道上皮的各种细胞类型。

图7. 肠干细胞培养技术及其鉴定

肠道干细胞体外培养的技术建立起来以后可以用于什么研究呢?我们知道整个消化道非常长,从胃到十二指肠、空肠、回肠、大肠、结肠,不同部位的干细胞是不是一样的?我们从一个流产的胎儿(21周)不同的肠道部位分别养出来干细胞,干细胞克隆在形态上是无法区分的,这些不同部位的干细胞在体外分化了以后,形态上出现了一些区别,大肠形成了比较粗的褶皱,小肠的褶皱就会比较细,这跟体内也是一致的。真正的肠道组织,如十二指肠、小肠、大肠,它们的杯状细胞的数量是不同的,大肠杯状细胞会比较多。体外培养的干细胞在体外分化成的三维的组织特点与其来源组织的特点是高度一致的。小肠干细胞分化出来结构与小肠的组织相似;大肠来源的干细胞在体外分化而成的结果和大肠组织相似。从另一个角度也说明了,肠道干细胞有命运决定的记忆,不会因为体外培养而发生变化,这些分化的命运是由细胞内在的一些基因、表观调控来决定的,我们的培养体系没有改变它的决定,对以后的研究也具有重要意义。

我们检测了整个基因表达谱,发现不同位置来源的干细胞基因表达大部分是相似的,但是也有不同,具有其自身的特点。肠道成体干细胞有一些共识的标志物也在我们培养的干细胞中高度表达,干细胞分化以后这些干细胞标志物的表达也降低了。

回答一个大家非常关心的问题,干细胞在体外经过培养了以后是不是还是安全的?它应用到临床上会不会发生癌变,为了回答这个问题,我们进行了安全性检测评估。在体外把培养了五代、十代、十五代、二十代、二十五代、不同代数的细胞做了基因组突变的分析。发现第十五代以前是非常稳定安全的,十五代以后开始有少量突变,前十五代可以产生大量的细胞完全满足临床应用的需求。我们检测到少量突变,但是这些突变首先不是原癌基因突变,并不是培养的体系让它发生了癌变,这些突变是随机发生的,人体内每时每刻增殖的细胞都有发生突变的概率,这种突变概率体内体外都有,大家也不用担心,体内有一些修复的功能,还有不好的、个别发生癌变了,免疫系统就识别并将其杀死,但是确实有一定的安全因素,我们应该做更多的安全检测再应用到人体,让大家放心。

长期在体外进行培养,这些干细胞的自我更新能力和分化潜能会不会发生改变呢?为了回答这个问题,我们把培养了不同代数、7代、17代、27代(接近一年的时间)的细胞再去做分化,发现长期培养的干细胞仍然能够分化成肠道上皮的几种功能细胞类型,克隆形成实验也表明长期培养的干细胞在自我更新、克隆形成能力上也没有发生改变。

在这个流域治理过程中,包括了养殖的这些粪污的消纳,也包括了农产品加工的废水和废弃物的一些资源化。也包括农业的种植模式的改善,也是把这些废弃物的微生物肥料的产品,在种植过程中,进行一些推广应用,从源头,可以消减面源的一些排放,有一个很好的消减率,实际上面源污染控制,从源头减排,还是最关键的环节。

综上所述,我们建立的新技术可以培养二维的干细胞,也可以形成三维的上皮组织结构,能够长期培养具有自我更新能力和多向分化能力的干细胞,成体干细胞内在的基因调控决定了细胞分化的命运,干细胞高度特异性表达干细胞标志物,基因组相对比较稳定。这个技术还可以创建疾病模型。我们介绍一下假膜性结肠炎。在一些医院里、社区里大量使用抗生素就会破坏人体的微生物菌群,有益菌就会被破坏掉,艰难梭菌是一种有害菌,大量使用抗生素它能大量的繁殖起来。它可以分泌毒素A和B,可以破坏肠道上皮细胞的紧密连接结构,导致肠道上皮通透性增加, 肠腔里面细菌可以非常容易入侵体内,严重的引发败血症导致死亡。

接下来我们创建了一个假膜性结肠炎的疾病模型(图8)。把艰难梭菌分泌出来的毒素A和B,处理体外培养的肠上皮组织,模拟体内毒素对肠上皮细胞的作用,在组织病理学、上皮屏障功能和基因表达分析上全方位的检测疾病模拟的情况。首先做了病理组织学上的检测,发现毒素A和B对上皮组织的影响和时间、剂量有关,时间越长、浓度越高对肠上皮结构破坏的程度越大。肠道上皮细胞紧密连接的标志物也受到了破坏。毒素会破坏肠道通透性(屏障功能)。我们设计了4KD荧光标记的葡萄糖苷,如果细胞间的紧密联系是很紧密的,大分子就不会透过肠道上皮到体内,外面的培养基就检测不到荧光值;如果上皮细胞间的紧密连接受到破坏,从而导致肠道上皮通透性增长了,这个时候大分子葡萄糖苷就会渗透到外面的培养基,在外面的培养基中检测到的荧光值就高了,这样就可以研究整个肠道上皮的屏障功能。实验结果表明毒素处理的肠上皮组织受到破坏,检测到的荧光值增高,表明通透性增加了,防御功能被毒素破坏了。在基因表达的层面,发现毒素处理以后基因的表达跟人体疾病的表达变化是一致的,信号通路变化也是一致的,表明我们成功构建了假膜性结肠炎的疾病模型。

图8. 假膜性结肠炎疾病模型

图9. 创新性技术平台的重要性及其广泛应用

这个技术除了可以培养肠道正常干细胞以外,肝脏、胃、胰腺等器官组织的干细胞都可以用这个技术来培养。可以构建很多疾病模型,比如可以将致癌物质处理肠道干细胞或者是处理肠道上皮细胞,研究癌变发生的过程。该技术除了可以培养正常的成体干细胞,还可以培养各种疾病状态下的干细胞。研究病人来源的疾病病理条件下的干细胞及其病变,寻找一些新的靶点,为临床提供一些策略,这是我们主要的研究工作(图9)。如果大家有什么问题我们也可以一起讨论,谢谢大家!

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【讨论与交流】

 

安锡培:谢谢陈冰老师、王霞老师的报告。我们知道再生医学最重要的内容是促进组织器官的再生,在戴老师的课题组,重点是子宫内膜的修复和神经修复,这是非常重要的。神经断了是不可逆的,如果能够把神经修复了这是非常重要的成果,甚至可以想象应该可以获得诺奖。下面是自由提问时间,大家有问题可以先提提。我要提个问题,ASIA分级是怎么分的?

肖志峰:ASIA评分分五级,是美国损伤协会的损伤分级,A级是完全损伤,就是损伤以下运动和感觉都没有,现在选择病人也是这样的,必须是损伤平面以下感觉和运动都没有,A级是全瘫了也没感觉没运动了。B级是有感觉,大小便会知道,但是动不了;运动是完全性没有的,但是感觉是存在的。C级是感觉和运动都存在,但是运动是不正常的,就是可以动,但是走不了。D级是感觉和运动也有,可以走但是不正常。E级是正常的。我们做的是完全性损伤,感觉和运动都没有的,对这些人来说基本上是不可以恢复的,哪怕是有感觉的恢复、大小便的恢复,对他的生活影响都是非常大的,如果大小便失禁,护理是次要的,会带来尿潴留等可能反流到肾脏带来全身性的损伤;一开始是大小便的改善、运动部分的改善,慢慢的借助辅助行走,是渐进的过程。

祝诚:我很感兴趣子宫内膜修复方面的问题,在二期先导上面有哪些进一步的突破,过去子宫内膜修复,因为小孩生出来了,但是文章投出去很困难,人家说机理不清楚,机理很难讲,而且还有很重要的是对照组,如果没有对照组,文章也不会发表的,对照组也会有很大的麻烦,第二个先导里面在子宫内膜恢复,从不能生育到生育,最近的进展是怎样的?

陈冰:临床入组上确实有这样的问题。一期先导的时候主要是材料结合细胞,包括自体的细胞,通过这样的策略来进行再生修复。子宫内膜的损伤类型不尽相同,现在想采取的是综合策略,包括运用一些再生因子。机理方面,目前我们也有文章发表,但是发的并不高,就是发在《中国科学》上面。确实遇到了您说的问题,人家会有疑问,对照组是怎么设置的,目前对机理也有一些研究,但是进一步的探索还是在继续进行的。

张相岐:我理解脊髓像一个电缆或者是像光纤一样,原来是从脑往下长,肯定对应到胳膊、到腿,再生了以后恢复比较好并没有长错,也就是腿还是腿的功能、手还是手的功能,这是训练的结果还是再生的时候可以找到原来的上下游呢。

肖志峰:两方面都有。原来大家有个担心,再生的神经长错了怎么办,其实现在发现细胞并没有长错,神经发育的时候最早期是形成很多突触的,慢慢都退化了,只要是不正确的连接都有退化的现象。损伤修复运动神经元就跟下游的运动相关神经连起来,不和感觉的长在一起;有些恢复确实跟康复有关,慢慢联系就建立起来了,不正确的连接慢慢也退化了。这个问题有一些理论性的研究,但是并不很确实。现在的问题在于真正搭起来的连接还是偏少,如何搭建是个问题,在这个基础上再通过康复再形成正确的连接。

张相岐:从A到B还是到D还是到E,跟搭建的数量是有关的,高位截瘫以后下面所有功能都不行了,有没有某一个器官非常的好,其他的器官没有恢复呢,就一只胳膊恢复的很好。

肖志峰:会有,不会对称的恢复,比如一条腿劲还可以,但是另一条腿动的少,脚指头有些可能恢复的比较好,有些可能是不行,恢复是有差别的。

姜亚东:人工干预可控吗?修复子宫内膜,如果不可控了,它会增生也会造成一些问题。

陈冰:首先我们的材料植入到人体有一个逐渐降解的过程,和人体自身的组织有逐渐的相融,不是植入进去就不变了,它会适应组织的生长,开始植入进去可能是一个支架的作用,有占位效应。但是人体很奇妙,自己会有一个再生的过程。同时这也是为什么要控制生长因子的使用,因为生长因子的作用很强大,可以诱导细胞的分化,我们将其与材料建立一个特异的结合,就让其局限在损伤的部位不让其扩散到其他的地方,这是可控的,量上有实验的探索,应用时使用合适的量,多了肯定不好。

汤火顺:干细胞有没有性别的问题,有没有跟染色体有关呢?我是做产前诊断的,我曾经做过一个细胞,本来是XY的,但是第二次做的时候出现了XX,如果是存在的话,对后代的情况有没有影响?

陈冰:加载在材料上的干细胞是促进子宫内膜组织的再生,跟胎儿无关,只是土壤坏了把土壤修复好了,和母体的卵子或者是父体的精子是无关的。

桂文庄:过去也听人讲到神经连接的问题,认为神经传导是生物电的传导,因此可以用碳纤维或者是用液态金属来导通生物电流来修复神经,今天你们是搞生物的,对这方面非常专业。你们对这种方法有什么评价,到底行不行

肖志峰:类似石墨烯导电进行刺激理论上也是可以的,但是到应用上有很长的距离,包括生物相容性、毒性怎么样,这是限制性的关键因素,包括电刺激可能是刺激其运动,来一个刺激仪就可以动了,不是通过组织再生来实现神经功能的改善,对运动有所改善,但是对感觉和大小便不会有什么作用,现在能够做到的刺激只能是通过刺激运动诱发电位,但是大小便感觉和控制现在没看到有报道。另一方面这种方法有一定负面作用,脊髓损伤的病人有可能有其他方面的问题,比如骨质疏松,有人戴了这种装置以后出现骨裂的情况。

桂文庄:深圳研究院做一个机器手,用胸部的神经刺激电流,指挥机器手的运动。

肖志峰:这种方法是有一些运动功能是可以达到的,但他们做的是被动的,刚戴上大家感觉很新奇;我们认为最好的方式是想动、主动的运动,这是最理想的方式。

孙勇如:从动物实验到人体去做,门槛包括监管有批准吗?

陈冰:首先得有大动物实验,要有安全性评价,然后是有效性评价,要上临床研究的产品必须进行标准化的研究,有一个标准的制备工艺,对理化性质、生物相容性、无菌、类毒素的检测、制敏性、免疫性、病毒灭活建立一系列的检测方法和标准。要去第三方检测部门拿到国家认可机构的检测报告。我们目前跟医院的合作,医院要用这些材料去过临床的伦理委员会,通过了以后进行临床研究;多中心临床试验需要有国家批文,我们目前做的是小样本的临床研究。

孙勇如:我印象新药的审批一直特别长。

陈冰:我们是属于第三类植入医疗器械,门槛会低一些。

赵世民:我们国家这方面确实是迎头赶上了,这个方向非常之重要,大家知道桑兰这名最优秀的运动员瘫痪了,这些运动不能正常进行的病人很多,如果能够在这个方面打开一个缺口,能够让她自理已经很不错了。当然说机械手、机械臂是另外一个方向,打仗合适、打不死,但是作为普通的人是应该做到D级相当不错了。我是糖尿病,我看到航天医院要移植胰岛细胞,我跟大夫讲这个能不能弄好,他说您这么大岁数了别弄了,瘤化了怎么办。因为人体自己调解,什么时候分裂都有一套完整的程序,是多少年进化过来的,我们如何控制,我们移植进入一些干细胞,怎么控制其按照人体自行发展规律去进行,这方面还有很多工作要做。

陈冰:您说的非常对。对干细胞实现精确控制是非常理想的状态,我们的技术目前还不能达到您说的这种特别理想的状态。我们的一个策略是让干细胞待在目标位置,不扩散到非靶标位置,这是一个技术,这和离您说的特别理想完全听从我们的命令是有距离的,也是我们努力的方向。

金振华:第二个报告我听的比较清楚,有些资料说人体微生物有两千克、有些说是四千克,而且各种人体的病变甚至于情绪都和微生物有关。我第一个问题是人体的肠道微生物,除了肠道以外分布在哪些可能的部位?第二个问题,人体微生物现在有怎样的培养方法,因为里面肯定有很多,至少有大肠杆菌、螺旋杆菌,还有一些是如果没有相应的培养基培养不出来,就无法识别也无法研究其功能。两公斤的人体微生物有的说法是除了人体基因组以外,它可以和人体基因组的表达相互是相关的,可能是有什么途径。我不知道国内是不是微生物你们所研究的范围,或者是哪些单位研究,人体微生物对基因表达通过什么途径会引起病变、引起人情绪的变化或者是各种疾病,这个也应该普及一下。

王霞:我个人感觉退行性疾病很多也是一些功能上衰退,但是有部分退行疾病也跟干细胞自我更新、分化能力有关,不能维持组织结构功能,部分是跟干细胞的退行相关,它是自然衰老的过程,但是干细胞长时间受到炎症和病理环境的影响,它的机能,自我更新分化发生了变化可能会引起退行,很多研究也往这个方面靠拢,怎么样来研究老年人的干细胞和年轻人干细胞相比有什么变化,怎么样让老年人的成体干细胞恢复年轻,都是在研究阶段。在治疗阶段,退行性疾病比如帕金森,有些认为成年人没有神经干细胞,脑里面的细胞不会自我更新,但是后期有人报道成年人脑中也有一些神经干细胞,也会进行更新。退行性疾病太复杂了,大家没有找到治疗的靶点,很多大的制药公司也在努力。目前很多机制是不清楚、找不准,但是这么多年一代代的努力应该会越来越好。

魏荣瑄:肠干细胞有四个,有没有路走错了?

王霞:很多研究表明,大部分的肠癌起源于成体干细胞,肠干细胞的自我更新在体内正常情况下是受到调控的,不会过度。这种正常的调控机理被破坏了,干细胞就不受控的生长成为肿瘤。但是人与人不同,大部分人肿瘤来源于肠道干细胞,也有一部分人来源于更分化一些的细胞,这又是非常非常复杂的问题,所以整个肿瘤的治疗领域还是比较难的。

微生物菌群有很多研究,最近非常火热,微生物目前我知道的它可以通过它的代谢产物跟肠道上皮干细胞相互作用,代谢产物也可能到血液里面对人体多种组织进行调控。微生物在体外培养也是一个问题,因为微生物种类非常多,如何找到一个培养基能够把肠道菌群里微生物安装比例、每个种类都不丢失培养起来是很难的。目前只能培养出一部分微生物,很多微生物在体外培养,即便是培养出来也有生长优势的问题,有些生长的快、慢慢把生长慢的压制了,所以人体真正菌群生长的比例很难在体外模拟。但是世界上很多实验室正在做这方面,也有做微生物菌群的测序分析,通过测序知道在哪些疾病里面、哪些类型的菌群就有优势、有作用,研究的很多。这个领域大家都在关注,但是可能有所不同,微生物所应该有很多研究。

安锡培:肠道微生物做的比较热,华大两位年轻人都30多岁,一个是从美国回来的,一个是土生土长的(学历只有高中),现在他做肠道微生物,还有一位田教授是从美国回来的,尝试做治疗自闭症,这方面也是一个方向,肠道微生物逐渐在活跃。

王霞:肠道微生物跟老年痴呆、很多神经疾病也相关和自闭症也相关,肠道微生物菌群和肿瘤也相互作用,所以是非常火的领域,但是具体什么机制也是正在摸索阶段。

肖志峰:干细胞一方面是创伤修复,另外一个方面是抗衰老。就衰老来说,大家宣传的确实有夸大的成份,但是还是有一定的基础,包括皮肤和神经。随着年龄增大干细胞的活性也变了,更新能力降低了,从这个角度来说通过补充一定的干细胞,创建一定的环境,替换损伤的器官可以恢复活力。有人报道拿年轻的小鼠血输注到老年老鼠体内可以“返老还童”,但是这个作用多大、如何更好的规范的使用是个问题,而不是跟大家宣传的一样,打一针就好了,这并不一定,但是也不是纯胡说八道,因为纯胡说八道就不会发展这么大了,它有其一定的道理,但是规范如何用、具体发挥作用还不是很清晰。理论上说随着年龄的增长、干细胞自我更新能力的降低,确实是存在这样的问题。干细胞一方面的作用是修复创伤,衰老中的作用研究也在逐渐发展。相信过一段时间慢慢正规起来这方面会有所发展的。

祝诚:干细胞研究的中心,最后的目的肯定要为临床服务,这是肯定的。一期干细胞与再生医学先导专项,成立的时候科学家来自各个方面,因为大家要争取经费,当时很多人做果蝇、斑马鱼,大家都进入了,说我们也是干细胞。后来方向很明确,如果将来没有考虑到为临床服务,请你不要参加这个研究。将来国家的审查和汇报肯定是拿了这么多钱(几亿)做这个工作你的社会作用是什么。二期干细胞先导专项是在一期的基础上更深入,现在的工作据我所知比预期的任务要复杂得多,而且难度大得多。将来的目的跟临床各方面有密切的关系,是不是方方面面都可能做也要挑选,不是一蹴而就。但我们也不能说太难了就慢慢做吧,这也是不可能的。有好的结果国家也会给予投入支持的,现在国家特别是中美贸易战以后,习主席也讲国之重器不能依靠外国人,一定要自己做,包括芯片的问题;重要的科研问题,国家一定会投入更多的精力来做,这样才能在世界上立于不败之地。

张相岐:前些年了解到你们在心血管治疗方面也有研究,现在进展到什么程度了呢?这个研究领域偏重于单能或者是多能的干细胞,当然不是全能干细胞,将来从产业化角度上讲,很可能是全能干细胞,让它分化成什么它就分化成什么,而不是肠道出问题就去肠道,肝出问题到肝上去,这样恐怕有些麻烦。涉及到定向分化和分化过程中保证不出现遗传变异的问题。我国到处在讲对此很重视,我们也投入量非常大,但是其实几十人团队太不够了。这类研究对医学是革命性的,对人类社会也是革命性的,这点钱、这点人远远不够,必须要多投钱、多投入人力和物力;而且最重要的是发言权,就是制定标准的权利,这很重要。现在投的这点钱和现在这点人是远远不够的,研究人员都很着急,各种各样问题都无法解决,领导没有依据很多事情就没有做,标准和法规也没有依据,标准靠科研人员做、法规是靠领导做的。

肖志峰:我们在心肌损伤再生修复领域的工作一直在进行。目前对于普通的心肌损伤有一定的效果,但严重的损伤效果会更明显一些。

张相岐:有没有到直接对患者的程度,比如原来的心急梗死现在已经恢复了。

肖志峰:射血分数和相关能力方面是可以看到的。

张相岐:这个问题解决了以后,可以消灭很多产业,包括支架、搭桥。现在三甲医院这样的治疗很多,新增搭桥手术经常都做到午夜。

汤火顺:这个工作很重要,领导一定要重视,不能让其自生自灭,而且应该有投资。不过现在有个团队非常好,有了团队也就可以发展了,我相信这个会议以后会有很大的发展,我开玩笑说最好是把老年痴呆的工作做的更快一些,我们这些人能够来享受一下。因为我们是80后的人,倒计时了,搞出来的话我们可以享受一下。

孙勇如:支持包括两个方面,包括经费和人力的支持,门槛的问题很重要,很多事情被卡死了,标准都是用外国的标准,为什么我们自己不能把门槛放低一些呢,明明知道很好的就不让你试,就死在实验室了,所以国家的支持一是经费人力上的支持,更重要的是标准上、门槛上的支持。

何光远:再生医学造福人类,我想了解目前治疗成功率是多少?这对科学研究是最重要的方面,就是成功率的问题。

肖志峰:就脊髓损伤来说,陈旧性的脊髓损伤对于反射性的小便感觉有些病人会有恢复,但是对于能够恢复运动的情况,陈旧性的比较难以看到,手的运动有所改善,但是胸段的没有运动,这是因为这种恢复非常复杂,比如陈旧性脊髓损伤病人,肌肉也萎缩了、外周神经也退化了,中枢神经即使修复了其他方面的恢复也不行,所以这是综合工程。对急性病人会好一些。但是陈旧性病人的有效性如何判断,这是个问题。医学上讲的有效率和治愈率是不一样的。陈旧性病人有的躺了十年马上想能站起来走了,实话说现在这是不现实的问题,因为涉及很多的方面。

何光远:病人全部是筛选过的,你是一千人只挑了50人,正好是认为通过再生医学可以显效的?

肖志峰:我解释一下“病人筛选”的问题,我们所说的筛选不是选我们认为可能能治好的病人,而是说要筛选没有自发恢复可能的病人,这样才能客观科学的评价我们的治疗方法。企业转化后要做所有人的随机对照,这有一套严格的医学统计学方法做指导,目前我们是做的小病例的研究,但同样也要有严格的病例筛选标准。真正大规模的临床试验,需要企业的研、产、医结合,经费需求量也不是小数目了,就不是科研经费了,得风投来做的。真正的有效性是通过后期的大规模临床试验才能得到,我们先期一是证明了安全,这是大家最关注的,一个新东西大家关注的是有效。但对于研发首先关注的是安全,用上去最起码不能出问题,不能带来不良反应,这块我们达到了,并且看到了一些效果,这些效果对制定后续的方案是有所帮助的。在我们临床研究的基础上,制定一个完整的方案,转化到企业,通过风投的投入,通过临床试验再形成产品再进行销售,真正说有效率是多少这并不好回答,我们只能说是安全的、能够看到效果,有效性的问题小病例是无法回答的,有效性可能需要严格的对照试验设计。所以现在有效性真的无法说,做十个有三个恢复是30%吗?其实不是的。

张相岐:能不能进行分级调控,全能干细胞分化到某一个阶段,用了以后再回来,分化到一定的程度再筛选一次,把需要的留下来,走错路的去除。

王霞:纯度可以进行选择,哪怕是得到纯度很高的细胞了,细胞的功能也很关键。比如分化出来的治疗糖尿病的胰岛细胞功能上可能不行,不会感应血糖的浓度来进行分泌胰岛素,就是功能上不成熟,现阶段是不行的,这是胚胎干细胞定向分化目前存在的问题。很多环境引起的疾病是用胚胎干细胞模拟不了的,胚胎干细胞可以更好地模拟遗传性的疾病模型,非遗传性的疾病,比如长时间的炎症、各种环境造成的疾病的发病机理是非常复杂的,这是用胚胎干细胞无法模拟的。这时候需要研究成体干细胞和疾病条件下的成体干细胞。 胚胎干细胞和成体干细胞,在方方面面都有其价值,各有利弊、方向不同。

张相岐:用自己的干细胞治自己的病,可能成功率相对也会高,将来要是产业化,有可能不会每个人基因都不一样嘛,我们希望有个库,就是全能干细胞,就像血液一样拿来就可以用了,取一些干细胞经过一些程序培养,前几年发现一个心脏节律性的收缩,这个进步已经很大了,用全能干细胞是不是有一天可以产业化。

王霞:自身的成体干细胞在分化上、功能上目前要比胚胎干细胞分化出来的效果要好,当然胚胎干细胞也是一个发展的过程,有好几条路同时开展研究,哪个更有效就用哪个,不能只用成体干细胞、或者只用胚胎干细胞,成体干细胞的研究也会指导胚胎干细胞的定向分化,这些是齐头并进的,世界上科学家也从各种角度来做。

张相岐:所以我们要争第一,要争取制定标准的权力。

安锡培:今天讨论很热烈,意犹未尽,如果有兴趣的话群里再进一步讨论。总的来看今天的问题应该归于大健康。大健康从国家层面很重视,4月份丁总理专门去了云南。云南搞了四千亩地,从康养到临床到医院都在做,重庆搞了五平方公里大健康基地,准备请科学院做健康研究院。这个信息可以给到大家,首先他们想建立一些临床的研究,如果大家有兴趣,包括昆明南山区、重庆大家都可以参加,一切费用由当地出。这应该是一个好的消息,因为地方钱有些还是可以用的,如果有这方面的意愿,或者是其他同志愿意参与的也可以,因为基本上是他们出钱。深圳也给了130个亿成立了一个研究院,当然这是包括基建费用。    总的来说,大健康是越来越得到重视。

今天大家讨论得很热烈,没有讨论完的会后可以再继续,今天沙龙到此结束。

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