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防御素抗病机理探索及应用前景

主办单位: 中国科学院老科协
承办单位:中国科学院老科协遗传发育所分会
举办时间:2017-08-10       【字号: 访问量:

目录

简介
主持人致辞
主旨报告
交流与讨论
邀请报告一
交流与讨论
邀请报告二
交流与讨论
主要专家简介:
  1. 安锡培(主持人):中科院遗传发育所高级工程师,分会秘书长
  2. 王义琴(主旨报告):中科院遗传发育所副研究员
  3. 陈宇红(邀请报告):中科院遗传发育所高级工程师,防御素研究开发
  4. 邓婷婷(邀请报告):中国检验检疫科学研究院博士
  5. (以下按姓氏笔画排列)
  6. 王  远:中科院动物所离退休办公室主管
  7. 王贵海:原中科院生物局局长,研究员
  8. 王  斌:中科院遗传发育所研究员,植物遗传学
  9. 刘  敏:中科院遗传发育所副研究员
  10. 汤火顺:中科院遗传发育所副研究员
  11. 孙庆庆:中科院遗传发育所离退休办公室主管
  12. 孙勇如:中科院遗传发育所研究员,分子遗传学
  13. 李文彬:中科院遗传发育所研究员,遗传学
  14. 李致洁:中科院老科协副理事长,研究员
  15. 何凤琴:中科院动物所副研究员
  16. 宋秋生:中科院遗传发育所,分会理事长
  17. 陈秀兰:中科院遗传发育所研究员,动物遗传学
  18. 金振华:中科院遗传发育所研究员,发育遗传学
  19. 胡赞民:中科院遗传发育所研究员,细胞遗传学
  20. 赵世民:中科院遗传发育所副研究员
  21. 胥伟华:中科院遗传发育所党委书记
  22. 桂文庄:中科院老科协副理事长研究员
  23. 黄玉萍:中科院遗传发育所离退休办公室主任,分会常务理事
  24. 麻莉雯:中农科院老科协办公室主任
  25. 景健康:中科院遗传发育所高级工程师
  26. 魏荣瑄:中科院遗传发育所研究员,细胞遗传学
展开

【简介】

 

防御素是生物体抵御病原微生物的防御反应过程中产生的一类抗微生物阳离子短肽,它在自然界是广泛存在的。防御素具有杀死细菌、真菌或者病毒等微生物并具有抗肿瘤活性的奇特功效,其特殊的毒性机理使得微生物难以产生抗性,所以防御素有望发展成为新一代的多肽抗生素药物,从而解决目前日益严重的抗生素耐药性问题。中科院遗传发育所的科研人员近年来在防御素的抗病机理研究、应用研究以及通过基因工程技术开发研究等多个方面都取得了很大进展,本期沙龙围绕防御素的抗病防病机理和基因工程生产应用方面展开讨论,希望能提出新的观点和建议。

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【主持人致辞】

 

安锡培:我们这次沙龙主要是讨论NP1抗病机理探索及应用前景,防御素是孙勇如老师在所里最早开始的,2003年部队、潜艇、海军都用过,发的手册上都有我就不多介绍了,下面请王义琴做主讲。

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【主旨报告】

 

王义琴: 防御素的抗病机理及研究进展

各位领导、各位专家、各位老前辈上午好,非常高兴有机会今天来讲一下防御素方面的进展。我跟大家分享的是防御素抗病机理及应用进展。

防御素最早是由1980年美国的Robert Lehrer命名的,它是生物体在抵御病原体的防御反应过程中产生的一种能拮抗微生物和一些恶性细胞的小分子短肽。防御素通常由29 ~ 54个氨基酸组成,其中包括6~8个保守半胱氨酸,可通过半胱氨酸分子内二硫键使肽环形成反向平行的β片状或α螺旋结构。

防御素分子结构稳定且具有非常广谱的抗菌活性,根据来源的不同,可分为动物防御素、植物防御素和昆虫防御素。防御素分子结构稳定且具有广谱的抗菌活性,根据分子结构特征的不同,动物防御素可分为α-防御素、β-防御素和θ-防御素3种。

α-防御素: 由美国Lehrer 实验室1980 年从兔肺巨噬细胞中首先分离得到, 是一种阳离子性极强的小分子抗菌肽。α-防御素主要存在于哺乳动物有关组织和细胞中。α-防御素分子由29~35 个氨基酸组成, 富含精氨酸, 非常保守的6 个半胱氨酸以Cys-l-Cys-6、Cys-2-Cys-4、Cys-3-Cys-5 方式形成3 对分子内二硫键, 其中Cys-l-Cys-6 对二硫键连接N 端和C 端的半胱氨酸形成分子大环, 所以α-防御素的一级结构一般为圆形。在兔的中性粒细胞中共发现有6 种α-防御素, 即RabNP-1、-2、-3a、-3b、-4、-5, 这些防御素总量占细胞蛋白质总量的15%~20%。

RaNP-1具有非常广谱的抑菌谱,它对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、被膜病毒、真菌、梅毒螺旋体等等都有很强的抗性,所以对这么广范围的病原体都能有治疗效果。

图1. 兔防御素RaNP-1广谱的抑菌谱

β-防御素也是由三对分子内的二硫键,形成的位置跟α-防御素不同,因此结构也不一样。防御素的抗菌活性很强,但是在受到盐浓度及血清成分影响下,α-和β-防御素的抗菌活性会降低, 但是只有12个氨基酸的θ-防御素的抗菌活性却几乎不受影响, 研究发现θ-防御素分子的环状结构可能是其保持稳定活性的原因。

与动物防御素相似,昆虫和植物防御素的特点,昆虫防御素也有三对二硫键Cys-1-Cys-4、Cys-2-Cys-5、Cys-3-Cys-6,但是植物防御素通常是有四对二硫键Cys-1-Cys-8、Cys-2-Cys-5、Cys-3-Cys-6、Cys-4-Cys-7。

防御素有如此广谱的抗性是在生物长期进化过程中与疾病斗争的结果。其抗微生物的作用机理可以分为抗菌作用机理、抗病毒的作用机理、细胞毒作用、免疫调节功能四个方面。

防御素抗菌的作用机理,目前有两种不同的抗菌作用机理被提出,一种是独立膜机制,另一种是防御素结合细胞内复合物的机制。独立膜机制的观点认为, 带正电荷的防御素与带负电荷的细菌细胞膜相互吸引,并相互结合,从而破坏了磷脂双分子层的完整性,引起靶细胞膜出现裂隙。可分为三个阶段:(1)由静电吸引。防御素与靶细胞膜结合。防御素带正电荷,可通过静电作用与带负电荷的细菌膜脂层结合;(2)通道形成。带正电荷的防御素分子或其多聚体则与细菌质膜上带负电荷的磷脂头部和水分子相互作用,显著地增加生物膜的通透性。防御素作用于膜上形成稳定的多个通道;(3)内容物外泄。通道形成后,防御素进入细胞内的同时,其他胞外分子也伴随进入(如肽、蛋白质或无机离子),而靶细胞的重要物质(如盐离子和大分子)渗出,细胞膜的通透性及细胞能量状态受到了破坏,导致细胞膜去极化,呼吸作用受到抑制以及细胞ATP含量下降, 离子和大分子物质通过细菌的细胞膜, 最终导致靶细胞死亡。

图2. 防御素的抗菌机理。

防御素与细胞内复合物结合,2013年在美国科学院院报PNAS上有篇文章报道发现人类β-防御素2在革兰氏阳性菌粪肠球菌毒力因子局部合成点高度聚集,从而破坏转肽酶Sortase的定位并影响了它的功能,导致毒力因子合成受阻,而破坏细菌的分裂达到杀菌的作用。

防御素抗病毒的作用机理,分三类:闭门羹、突破口、地雷阵。

闭门羹-阻止病毒入侵宿主细胞,病毒感染细胞采用“两步走”政策:首先,病毒的外衣即包膜死缠烂打地粘着到细胞的外膜上;接着,病毒包膜与细胞膜融合在一起。两个膜融合后,病毒就将它的遗传物质插入到细胞中。防御素则斜插在糖蛋白上以防病毒向细胞糖蛋白的扩散,让病毒吃个“闭门羹”无法进入细胞。没能进入细胞的病毒接着会被免疫系统的细胞摧毁。

突破口-杀灭病毒,防御素通常带多个正的净电荷,而病毒囊膜及其表面糖蛋白通常带负电。这使得防御素像一块块小磁铁,吸附到病毒囊膜带负电荷的糖蛋白上。这样便使囊膜病毒穿孔,形成突破口,内容物外泄而死亡。这与防御素对细菌的杀灭作用相类似。

地雷阵-阻止病毒基因复制与转录,万一病毒进入细胞内,防御素可以与细胞膜表面促肾上腺皮质激素 (ACTH),人硫酸肝素糖蛋白(HSPG),低密度脂蛋白受体(LDLR)等相结合,从而启动G蛋白偶联型受体的级联放大反应,进一步激活磷酸激酶C。这些细胞信使作用就像埋伏在胞内的地雷,可以阻止整合到宿主基因组之前的病毒复合体进入细胞核或者阻止病毒的基因转录。整合不到宿主基因组的病毒随后被摧毁。病毒虽然进入细胞,但是碰到地雷就被阻止了,整合不到基因组就被消灭掉了。

随着研究发现,人们发现防御素有细胞毒作用,它对人的淋巴细胞、实体瘤细胞毒作用更显著的,近些年来,发表了一系列的这方面的研究文章。早在1993年,在我们国家的《中国病理生理杂志》,就有一位科技工作者做了兔中性细胞防御素的细胞毒研究,随着浓度的升高,RaNP-1和RaNP-2对HL-60细胞系的毒性是逐渐增强的。对抗 TNF 的 U9TR 细胞、抗NK细胞细胞毒因子的小鼠淋巴瘤 YAC-1 细胞和人组织细胞淋巴瘤 U937 细胞具有杀伤性。在体外,HNP可抑制烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)氧化酶的活性,HNP的细胞毒活性部分依赖于靶细胞膜脂质成分的代谢活性,它还可以与过氧化氢酶协同诱导细胞毒作用。体外观察纯化防御素对人及小鼠数种肿瘤细胞的杀伤作用,发现防御素对白血病细胞系、淋巴瘤细胞系及实体瘤细胞均具有细胞毒作用,并且这种抗肿瘤功效与其作用时间和剂量呈正相关。

防御素的免疫调节作用,防御素能够作为一种效应分子激活巨噬细胞、DC、气管上皮细胞等细胞表面受体从而启动获得性免疫系统,并将先天性免疫和获得性免疫有机连接。防御素可以上调巨噬细胞趋化因子表达并进一步招募T细胞、单核细胞和未成熟树突状细胞(DC)和触发适应性免疫控制病毒感染。通过防御素肿瘤机理防御素是自身防御体系重要的组成部分,组成机理非常独特的,是通过电荷上去的,病原物不能产生抗药性。

下面简单介绍防御素研究进展,一个是防御素功能研究进展,在医学、食品工业畜牧业、还有防御素的基因工程研究进展。

防御素在医学中的研究进展,与口腔黏膜疾病的关系、与炎症性肠病的关系、与慢性阻塞性肺部疾病的关系、防御素的临床药用研究。

防御素与口腔黏膜疾病,研究发现,防御素家族在口腔黏膜宿主防御及免疫应答过程中发挥着重要作用,与多种口腔黏膜疾病(口腔溃疡、扁平苔藓、白斑及口腔念珠菌病等)关系密切。现今关于这方面的研究尚处于起步阶段,主要以体外实验为主,其作用机制也多为推测。感受到病毒侵染的信号,人的黏膜上皮细胞会产生防御素β-defensin-2 (HBD2) and HBD3 来抵抗病毒。

防御素与炎症性肠病的关系,研究发现,肠道上皮细胞中防御素起着影响肠道黏膜的天然屏障作用,防御素表达水平的降低会导致黏膜细菌附着并入侵机体引发炎症反应。肠道慢性炎症疾病克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)均与回肠潘氏细胞防御素HD-5、HD-6 的表达相关异常相关。原理是什么?2012年在Sciene发表的研究结果显示以防御素为主的免疫分子能够制造纳米网捕捉沙门氏菌等肠道微生物。

防御素与慢性阻塞性肺部疾病的关系,HBD-2 与呼吸系统疾病关系紧密,在肺部黏膜防御中具有重要作用。研究证实,HBD-2 的产生或作用被抑制后,机体将发生肺部感染,人为补充外源性防御素可能会阻止细菌的定植和感染的发生。已有研究证实,重组 HBD-2 对肺损伤具有保护作用,可减少绿脓杆菌感染大鼠肺组织的菌落数。

最近一篇文章是在猪里面表达β-防御素2基因(β-BD-2)增强对胸膜肺炎放线杆菌的抗性,野生型猪的肺部显示出血、水肿,严重的拥塞和嗜中性粒细胞浸润。转基因的猪肺部表现出轻微出血,中度充血,轻度中性粒细胞浸润。

防御素有独特的机理,微生物不容易产生抗药性,抗菌谱广,所以它在临床上有非常大的药用潜力。2008年,全球首个防御素药物(PMX-30063)在加拿大获得批准并进行一期临床试验。PMX-30063药物的特色,全新的作用机制,细菌不易产生耐药性;对革兰氏阳性和阴性菌均有活性,特别是对包括89种耐药葡萄球菌在内的146种葡萄球菌有抗菌活性;是一种杀菌剂,即能直接杀灭细胞而且杀菌速度快于许多抗生素;对耐药菌有活性,包括多种耐万古霉素和耐甲氧西林的临床分离株。从而有望解决日渐增多的细菌耐药性问题!

基于昆虫防御素的新分子设计,动物所朱顺义研究组通过单点突变将昆虫防御素羧基端β-折叠片层结构改造成典型的β-发夹肽结构,获得的14aa的小肽命名为NvBH。研究发现在低的微摩尔浓度下,NvBH无论在完全氧化或部分氧化的状态下均有较强的抑菌活性(包括一些耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌临床分离株)。NvBH具有低的溶血性和高的血清稳定性和蛋白酶抗性,使其成为一个新型的抗感染类药物先导物。希望他们早日研发成功。

防御素在食品工业中的可能应用,防御素具有耐热的特点,作为食品防腐剂可用于热加工食品的防腐保鲜。此外,它还可被用于防止巴氏杀菌后的再污染。

防御素在畜牧业中的研究进展,目前来讲我们国家畜牧业养殖过程当中,抗生素添加剂的使用严重破坏了动物肠道的微生态平衡,药物残留也影响了畜产品的品质和人类健康,而来源于哺乳动物的防御素相对分子质量较小,热稳定性和水溶性均较好,可以在肠道内吸收。由于防御素属于多肽成分,在体内容易被蛋白酶降解为氨基酸,动物采食后在体内一般无残留。可以开发成环保型防御素饲料添加剂或兽药。目前已经有很多商品型的重组β-防御素在进行销售了。

防御素的基因工程生产,以转基因小球藻为生物反应器生产兔防御素的研究具有自主知识产权,处于国际领先地位。小球藻是一个单细胞藻类,培养很简单。转基因小球藻的高效生物反应器特别有效,因为小球藻单细胞、培养简单;繁殖速度快、可大规模培养;无内毒素;蛋白、多糖含量高,营养价值高;可作为高效生物反应器平台。

另外也有研究用酵母系统大规模重组表达防御素,除此之外,防御素在农业中可用于农作物抗病育种研究。我们课题组2001年将兔防御素 NP-1转入小麦植株,田间抗病虫鉴定结果显示小麦对于白粉病、叶锈和条锈病的抗性均有较大提高。而将兔防御素 NP-1基因构建至植物表达载体中获得转基因番茄的抗病实验结果表明,其对番茄青枯病具有抗性,为番茄的抗病育种工作奠定了基础。玉米防御素PDC1抑制了禾谷镰刀菌的生长,效果还是非常明显的。另外在小麦里面过表达植物防御素MtDef4.2的转基因小麦可显著增强对小麦叶锈菌的抗性。

防御素的功能并不仅限于防御,目前随着研究进一步发现防御素功能非常广谱,HNP可成为儿童体重指数和腹部脂肪沉积的经典标记物,另外一个β-防御素基因突变会导致家犬毛色的变化这些结果拓展β-防御素的功能作用。所以说防御素的功能研究目前只是发现冰山一角,更多的功能等待发掘。

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【交流与讨论】

 

安锡培:我们所从孙老师到胡老师做了20年做的是α-防御素。它的抗菌活性特别强,我记得2003年还帮着做在海军的潜艇,用在海军潜水队员身上,非常有效,一喷就好,尤其是口腔溃疡真正是有效的。饲料应用也很快,饲料催肥不用其他的东西代替。我们这次沙龙院老科协主要领导都来了,王局长、李局长、桂局长,还有我们所的胥书记和老书记宋秋生。在座有6个同事参与过这个事情,我们现在根据王义琴的主旨报告讨论一下,大家有哪些不明白,哪些需要可以进一步讨论,请大家畅所欲言。

王贵海:听了王义琴的报告,介绍很系统,应该说防御素是生物体内的,在动物、微生物普遍存在的一个对外防御体系的重要组成部分。生物体系防御体系是多方面,这么一个重要的生物学的防御机制,而且防御素是一个小分子多肽蛋白,机制还是都比较清楚的。它的作用机制是独立发挥作用还是跟免疫系统联合发挥作用? 我关心的这么重要的蛋白α、β防御素,在机制研究方面好像没有在生物学上形成热点,为什么?第二个是问题在在生物体内它是维持一个稳定的含量,还是在应答时表达出来了呢?比如说细菌感染、病毒侵蚀它的表达量就高起来了,是α还是β多?作为应用发方面,前途又如何?如果在抗病毒方面有特殊作用那很不错,因为它有三种防御机制,进来可以堵,到了细胞可以影响转录,最后是地雷,整个非常好的一种抗病毒的策略。你们做的是小球藻反应器表达量多少?

胡赞民:目前小球藻中防御素的表达量可以达到每升100毫克。

王贵海:那还可以,因为是多肽,可能不稳定。

赵世民:这么好东西为什么没有应用,如果是药应该往哪个方向发展,比如说闹肚子、肠炎,黄连素就解决问题了,花不了几块钱,如果用防御素去解决问题那钱要花很多了。我们应该瞄准其它的药解决不了,只有它才能解决的病,国际上炒这么热,胡老师和陈总一直坚持下去搞了很多工作。还有一个就是小球藻,作为植物反应器来讲不产生手性的问题,治病就治病不会产生其他副作用,那小球藻反应器非常重要。

胡赞民:防御素在应用上也不是说没有进展,进展挺大的,像临床一期、二期都有在做,我觉得问题有两个方面,一个是生产成本太高,现在防御素化学合成活性很低,因为有几个二硫键,要从生物里面提取含量非常低的,有时候是诱导性的,一感染量就上来了,平常量很低,生产成本是一大块,化学合成有护舷的问题。

王贵海:二三个二硫键合成起来应该不困难,这么好药物多贵都没关系。

胡赞民:目前的问题是合成的防御素活性很低,可能跟二硫键在体外不能正确配对有关系。

王贵海:复性试验做过没有,加热破坏二硫键,然后复性,二硫键怎么样,做过吗?

胡赞民:功能没丧失,煮开了防御素的功能也不会丧失。还有泡在酒精里防御素的功能也不变。

王贵海:这么皮实的东西,真不错! 因为多肽药物就是不稳定、娇气,但是它的作用很好,你们这个多肽药物这么稳定在应用开发是非常方便的,你们在动物身上做过实验吗?

孙勇如:防御素做成药,小球藻平台建立起来,我能生产小球藻还能生产凝血因子,说明这个平台在基因药物里面非常有价值的,现在小球藻问题是1995年上了国家科技攻关项目,这个是非常非常不容易,上去了。但是到十五就没有了,整个国家科技攻关统统取消,只剩下一个项目,所以我们组没有延续下去。直到2005年实际上别的经费来维持它,做再深入研究很难。应该说我一直看好这个项目,但是发展还是有些慢。

王贵海:小球藻就是一个表达体系,分离提纯太难了,得率很低。

孙勇如:关键是基因工程,当时那个时候报道美国有酵母生产人的防御素,生产出来没有活性。我们的项目成立的时候这是一个对比,那个时候还没有。

王贵海:小球藻有活性吗?

孙勇如:当时报道没有,所以选了小球藻。因为藻类里面能够规模培养的原核里面是螺旋藻,真核里面是小球藻。

胡赞民:我接着说说生产的问题,这么多年建小球藻的系统,可以培养10吨级,表达防御素的很多。所以用它去做少量的动物实验是可以的,目前更看重的是小球藻表达系统不经过提纯直接应用,因为小球藻本身是可以吃的,提高免疫力,提高动物的健康和产量那也很好。所以我们弄了一个发现,药也可以做,为什么现在防御素现在没有一个药能够成功的,我想有一个很重要的原因,就是活性没有完全解决。

有一个像临床实验马甘宁,最后做了很长时间,从青蛙身上提取的,最后它的有效性和剂量跟有毒性剂量接近就枪毙了。防御素有个缺点有血清的情况下就失活,未来做要药物是口服的,或者是外用的,做系统用药还是没问题的。

安锡培:我们这个阶段讨论就到这里,大概提了几个问题重要的机理和药理研究,还有关于小球藻反应器的也值得研究,为什么防御素没有形成很好的药物关键是毒性没有解决,现在这个阶段就到这里,下面请陈宇红做演讲。

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【邀请报告一】

 

陈宇红:兔防御素NP-1规模化生产及其应用研究

各位专家、各位老师上午好,我主要把我们研究室在防御素这几年做的不同方向研究结果向大家汇报一下。

兔防御素(Netrophile Peptide-1NP-1):来自兔嗜中性粒细胞,33个氨基酸,α防御素,由非常保守的6个半胱氨酸形成三对二硫键。二硫键的正确配对直接影响到防御素的活性。理化性质分析:溶于水和乙醇;经100℃处理5分钟后其生物活性未变化;经pH 3.0处理12小时的生物活性未变化;37℃下经胃蛋白酶消化(pH3.2)12小时的生物活性也未发生变化。 因为有很稳定性质,对它应用奠定了基础。

防御素NP-1规模化生产和转基因安全评价,我们利用发酵罐可以规模生产NP-1,在10吨发酵罐中159小时,转NP-1基因小球藻干重达105.57每千克,其中NP-1达到105毫克每升,产量远高于文献报道。转基因安全评价我们已经获得农业部环境释放许可,并通过环境部环境中心检测致敏性分析、急毒实验、慢毒实验和三致实验。

防御素NP-1研究分为以下几点。第一个小球藻表达NP-1可以提高靶动物的免疫力促进其生产量,项目来源是国家“十二五”科技支撑计划防御素NP-1中试生产关键技术及其在饲料添加剂中的应用研究。有效性研究,以白羽肉鸡作为靶动物,参试组至少包括阴性对照组、抗生素组、对各组鸡进行空腹测量体重,推荐剂量(1% NP-1藻粉),比阴性对照组(野生藻类粉)增重11.5%;比抗生素组5.4%,多倍剂量组(1% NP-1藻粉)与推荐剂量组无显著差异,证明了推荐剂量组作为饲料添加剂喂白羽肉鸡具有有效性,并且可以替代抗生素。

安全性实验,多倍剂量组的血生化、血常规、、脏器系数、肌肉率、组织病理学以及骨髓分析未见异常,证明了推荐剂量组作为饲料添加剂饲喂白羽肉鸡具有安全性。

十二指肠病理结果,阴性对照,绒毛短粗、排列松散,提示吸收功能较弱; NP-1两组,绒毛细长,排列紧密,提示吸收功能较强。 统计学分析结果:绒毛长度、V/C 比值   CK组 和NP-1各组差异显著。NP-1两组之间差异不显著。

十二指肠病理切片情况,这是千分之一,这是百分之一的NP-1,我们看到肠道有很多小黑点是淋巴系统,免疫细胞比阴性对照组多,肠道免疫就很强,阴性对照组看到比较多的中性粒细胞,吞噬细胞比较多,粉红色的细胞是嗜酸细胞,肠道的情况揭示了有炎症反应,有轻度过敏。脾脏的病理结构,两个NP-1组出现了脾小体,阴性对照白脾不多,而是红脾的比较多。

我们通过粪便菌群的情况,我们百分之一跟千分之一NP-1的对照组,淡绿色的是益生菌或者是非致病,抗生素跟阴性百分比增多了,肠道免疫也是非常好的状态。经过上面分析,我们现在初步认为这可能就是造成靶动物在出栏时生物量增加的原理,这是一个初步探讨。

小球藻表达的NP-1具有广谱的微生物抗性,项目来源“十二五”国家科技863计划,小球藻表达兔防御素NP-1临床前研究,应用方向是生物医药,我们通过研究做了细菌、真菌实验,像淋病奈瑟氏菌、对沙门氏菌引发的感染有明显疗效等等。

这个是小球藻表达NP-1对多种真菌临床分离株抑菌效果,株系是北医三院真菌室的临床分离株,采用10 mg的NP-1药敏纸片对其有非常明显的抑制作用,对照为含有醋酸的缓冲液。小球藻表达的NP-1对多种霉菌抑菌效果;株系是中科院微生物研究所环境分离株,采用10 mg的NP-1药敏纸片对其有非常明显的抑制作用,对照为甲壳素。小球藻表达的NP-1对灰葡萄孢霉引发的草莓 腐烂的保鲜效果,对照组:仅用配料喷涂后96小时霉变率100%,实验组:NP-1复配的保鲜剂喷涂后96小时霉变率20%。基因工程表达的NP-1对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的药敏试验,我们发现在每毫升8微克情况下有很好抑制作用,对照选的是头孢西丁。我们同样用这个菌又感染了大鼠,把大鼠后背平行切割,然后是接触MRSA感染,开始给药,治疗5天后处死。之后做了病理切片,已经有新的表面形成,有结痂。小球藻兔防御素NP-1对MRSA形态结构的影响,这是进一步揭示了NP-1对细菌的杀菌机理。

小球藻表达的NP-1可以诱导上皮细胞、成纤维细胞有丝分裂修复创伤,合作单位306医院,应用方向生物医药,表达NP-1可以修复ICR小鼠皮肤创伤,通过肉眼看得出来,实验组伤口很小了,对照组伤口没有任何愈合情况,处死以后做了病理切片,表皮在实验组形成非常良好,没有渗出。在实验组里面没有表皮形成,有渗出,肌肉下面组织有坏死了,可以看得出来伤口好重。

表达NP-1可以修复豚鼠的口腔黏膜损伤,就是口腔溃疡,每日两次NP-1 20毫克,76小时处理,溃疡明显减小,在对照组看的非常清楚,溃疡清晰可见,实验组里面鳞状上皮完全愈合,没有渗出,对照组没有愈合,有明显的渗出。

小球藻表达的NP-1可以直接促进损伤神经修复和再生,合作单位北京大学人民医院,应用方向是生物医药。神经递质L-谷氨酸的兴奋作用相当程度上受兔防御素NP-1影响。防御素的作用机制可能涉及突触传递的改变,且由神经递质L-谷氨酸介导。5-羟色胺受体可能参与了NP-1与感觉神经元的相互作用。兔防御素NP-1与感觉神经元细胞膜相互作用的机制可能是通过防御素中第十四位酸性氨基酸Glu(谷氨酸)的羧基与膜受体形成氢键作用。对神经的保护功能可能是通过阻碍细胞凋亡,增加细胞增殖和促进中枢神经系统创伤愈合。

我们在大鼠的坐骨神经做一个套管,2个月会自动在体会吸收,中间留了5毫米缝隙,设置了3个组,一个是NP-1组,在套管里面100毫克的NP-1,第二个给了NGF,第三组是氯化钠,持续8周实验,测试了很多参数,像神经传导率、老鼠走路步态等等。现在给大家看一下神经元胞体逆行示踪,氯化钠神经形成的非常差,我们又做了有髓锇酸染色,在一定波长下如果长出来就可以看细胞,NP-1和NGF经过统计学分析,也发现神经元胞体恢复没差异,氯化钠这一组基本上没怎么形成。

以上是我们对NP-1不同应用方向进行一下探讨,我们也很希望在下面的工作当中能够获得更多国家经费的支持或者是企业横向资助,不管哪个方向都能够促使项目真正做到产业化。在这个过程中非常感谢孙勇如、赵世民、 胡赞民老师的支持,国家863计划,中科院重点部署项目、国家科技支撑计划和保罗生物的资助,华中农业大学的支持和管理,参与本研究的中国科学院遗传与发育生物学研究所、北京大学医学部、北京大学人民医院,306医院工作人员和学生。

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【交流与讨论】

 

安锡培:下面我们针对陈宇红的报告进行讨论,看看防御素目前在应用方面,还有哪些比较成熟的。

赵世民:我记得还有一个个例,胡赞民的同学孩子眼睛真菌感染,知道他搞这个,就跟他要了一点,他那个同学真敢干,就给他的孩子使用,后来孩子就好了,而且上学了,后来我就不知道怎么样了,这是个例,起码是对真菌感染有效。

魏荣瑄:我听到是挺震撼的,还能抗防腐,假如说这样的话,小肽的东西,又是广谱的,开辟了一个很好的思路,这个是很鼓舞的。在一个小球藻表达系统很好,在北大困难时期说一个小球藻片顶一个馒头非常的吸引人,这个系统结合药物、广谱性,再有小球藻表达系统很有应用性。

王贵海:我想问一个问题,它的应用前景非常好。“十二五”项目作为增加动物的抗病性和促进生长已经做了不少实验,证明了它的有效性和安全性。有效性我注意到增长百分之十一点几,抗病性是怎么做的?我看你做了很多病理切片,整体动物实验做过吗?

陈宇红:我们分不同的应用方向,您说的有效性是我承担的饲料添加剂的课题,实际上为什么体重会增多,通过病理切片发现肠道和脾脏免疫提高了,对病源微生物免疫,比如说肠道里的细胞的结构,提高的是机体的机能的。

王贵海:但一定要证明在个体水平上。对照组是怎么做的?

陈宇红:我们做了一个对照野生小球藻对照组。

王贵海:要做感染组和感染对照组,看看发病的情况。经过严格的试验,才能作为正式畜牧药物和营养品上市,在组织水平上也要做大量的观察,所有的试验动物都要宰杀做病理。

陈宇红:我们做了六个平行拦。

王贵海:你们是做鸡的是吗?

陈宇红:对。

王贵海:100只鸡太好做了,你可以试试做禽流感。

陈宇红:我的课题主要是做饲料添加剂。

王贵海:这种饲料增加了免疫力,死亡率降低了。你的们病理切片很好、不错的。产品的研发要作必须要按照规范去做,这是一个问题。第二个有效性,你说多倍剂量组没有负作用,有多少倍?

陈宇红:有一个推荐剂量组,认为按照这个剂量,多倍剂量组是5到10倍。

王贵海:增加有效性,没有增加毒性。安全性一定要按照要求,多倍提法太含糊,增加百倍的饲料喂食动物,要做多长时间的观察,审视对以后遗传有没有影响。

陈宇红:您说的这个评价我们是做1000倍的。

胡赞民:王局长您说的非常好,作为饲料添加剂的话是靶动物安全性5倍、10倍是可以的,如果做毒性评价是小鼠,在小鼠里面是1000倍的。

王贵海:这个我是外行,数据要规范,要按照食品管理办法去做,才能通过食品添加剂产品的证书。

胡赞民:还有农业部转基因安全评价的。

王贵海:你们拿到的是什么?

陈宇红:致敏性分析、急毒实验、慢毒实验,三致实验。

孙勇如:为什么我们设计的时候小球藻表达兔防御素NP-1不表达了人防御素,就怕使用时间长了抗生素失效了。

王贵海:兔防御素NP-1就不耐药了?

孙勇如:生产时为什么不生产人防御素而生产兔防御素NP-1,那样对人没威胁,对兔子就有威胁了,抗生素是一个大问题,本世纪初出现了万古霉素,大家觉得抗生素不灵了,现在十几年来了只增加了14个病理耐药菌出现,大家比较信心。最近2014年11月份,中国报道了出现了对多元菌素B的耐药菌出现了,这个菌2015年10个国家发现,到去年2016年又出现了耐药性,这个耐药性多元菌素出现了,大量应用在畜牧业上,利用非常广泛,耐药菌的出现了大家非常恐慌。但是我们防御素有没有效果,不知道。

胡赞民:现在防御素、抗菌素用于调节防御能力,我们用的剂量是一公斤饲料加一克小球藻,一毫克的NP-1,一公斤饲料里面只有一毫克的,它的剂量是杀不了菌的。

王贵海:它跟藻体结合以后,到了鸡肚子里肽还存在吗?

胡赞民:过了十二指肠以后,到了空肠以后就没有了。

王贵海:到哪吸收的?

胡赞民:实际上是刺激肠道,刺激它免疫的反应,肠道细胞及反应,拉出来的时候没有了。

王贵海:兔的防御肽吃了以后在什么地方吸收,要做防御素的生理代谢,一旦吃进去到胃里就变成氨基酸了,如果人吃多肽药物是肠溶的,这个才起作用。用小球藻做兔子防御素做添加剂是非常好的想法,不用把兔防御素NP-1提取出来,表达就行了,定量就行了,规范做饲料小球藻粉,饲料标准定下来,多少克藻分,多少肽装到袋子里就可以了,然后观察产品的稳定性。

胡赞民:我们一直想要做药肽原理学。

王贵海:最好做药代的研究,不用鸡做,用老鼠做更方便。

赵世民:让谁做都拿钱啊,所里经费是有限的,你找谁都要交钱的。

孙勇如:我曾经胃出血疼死了,就煮小球藻,煮开了喝了就特别好。

王贵海:这是我刚才的一个建议,尽快突破作为饲料研发,这个最容易突破的,完了以后这么多饲料不管是鸡还是其他都有很大市场。

赵世民:您说的跟我们的思想真的不一样。

王贵海:你要做药会非常难,如果做饲料,市场效益也会非常好。所以这么好的东西一定要选一个很好的突破点,如果作药, 必须要选择一个合适的适应症,然后一步步按成药性研究。我看好你们这个防御素,目标一定要清,然后走一个非常捷径的路,容易走。

安锡培:谢谢王局,王局每次都能说到点子上,下面请邓婷婷博士发言。

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【邀请报告二】

 

邓婷婷:小球藻表达体系研究进展

小球藻作为它的特性和生物反应前面两位报告人都提到了,易培养、生长快、成本低等等。小球藻跟其他生物细胞相比,有生产上的优势。目前用小球藻作为生物反应器转化,用的启动子、载体大部分来自于高等植物,也是真核生物。

小球藻报告和筛选基因有所体现,文献用的最多是萤火虫和绿色荧光蛋白比较多的等等,这些报道应用情况也不知道应用成为成熟,今天听报告感觉防御素应用还是比较多的。

转基因小球藻的表达水平和稳定性受很多因素影响,外源基因表达水平低甚至表达被抑制的状况经常发生;外源基因表达的最大困难是缺乏足够的调控序列;另外,未使用偏好密码子、不正确的聚腺苷酸化、不适当的核运输以及不稳定的mRNA,均可能导致基因沉默。

小球藻生物反应器的发展,优化已建成的遗传转化体系,提高外源基因的转化效率和表达水平,形成高效稳定的外源基因转化系统;深入开展小球藻的分子遗传学研究,使其成为既具良好培养基础和应用潜力,又具有清晰遗传背景的新型研究体系。

小球藻应用展望,前几个报告人都提到了,一作为生物反应器生产各类物质;二利用基因工程培育优良藻种;三藻类天然产物的生产;四藻类基因在农作物改良中的应用。

我简单讲的就是这些,也比较浅显,抛砖引玉,多交流。

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【交流与讨论】

 

安锡培:刚才邓婷婷讲了一下小球藻研究趋势、应用和表达体系,我们根据她讲的内容,结合前两段再进行讨论,大家看看还有什么提出的想法和问题。

孙勇如:我原来的想法希望小球藻作为生物反应器能够越来越多的被应用,所以退休前2004年就写了一篇文章《小球藻新型的生物反应体》,我希望大家能够引起重视,除了这个防御素转到小球藻,凝血基因转到小球藻,如果这个平台建好的话,基因工程药物类是非常好的。防御素正确表达了,有功能了,用小球藻来证明到底行不行?最后表达了是有功能的,当然没有最后成作用,总觉得这条路是通的,这个平台作为基因工程药,我觉得有很大优势,不光是一个新型药,多生成一个药来。但是以前没做好,没选择抗癌的药,跟药一接触就知道,人家一听是抗癌有兴趣我跟你合作,防御素跟抗癌没关系就不想投钱,抗癌的药喊的响,防御素没喊响,我希望在这方面工作能够继续。

何凤琴:你说抗癌,我是动物所的,今天特别感谢遗传发育所的邀请,2005年以前接了一本书,让我写苍蝇的研究,后来查出癌症了,就不想签合同了。我研究苍蝇的抗菌肽、抗菌蛋白、防御素,我也是从北大出来的,我2005年退休的,退休以后我舍不得我那苍蝇,两个组一间房里,我后来肿瘤又复发了,长了五个以上肿块,我后来就吃那个蛆,现在已经过去12年了,没事儿了。

孙勇如:康富新(音)是从蟑螂提取的药。

李文彬:是从蟑螂用酒精提取的,修复胃黏膜,美洲大镰。

孙勇如:我觉得蛆里面起作用的还是抗菌肽。

汤火顺:抗菌肽的作用很大,我做过法国蜗牛,一炒非常的香,外面的人闻到就找到我炒的地方来,你们在干什么炒的那么香,我就把这个蛆配合饲料养法国蜗牛,长的非常漂亮。我后来养牛蛙的时候就更好了,还没有断尾上陆地时候吃蛆长的非常快。那个时候养了7个月蛙就达到1斤左右了。后来我把蛆加工完以后做刚才提到的抗菌肽的问题,和四个细菌和青霉素比较,都非常的有效。有的比青霉素抑菌效率更高,为什么要提到这个问题?因为蛆生长非常快,繁殖非常快、成本非常底,奶粉跟红糖就可以了。

何凤琴:现在我叫神虫。吃完一喝水挺好的。

孙勇如:吃了几天?

何凤琴:一边干活一边吃,拿微波炉就成了,饿了就吃。

胡赞民:要直接提取的话也容易。

何凤琴:提取费钱。

赵世民:这些可能要用综合性的东西,真正提取出来以后,要分析它,药在生物学怎么弄的,从哪排出来。如果不提取它,就像中药似的,就混在一起吃了治病。

孙勇如:就像康富新的药说明副作用,剂量什么尚不明确、原理是什么尚不明确,那药理就批下来了。像胃溃疡也是,康富新你喝了就行。

赵世民:我今天听三位的演讲,有了新的了解,做了多少工作,占了多大比例,对我们以后有启示作用,哪些方面还没有涉猎,我们应该在这个方面多下功夫,哪个方面做了大量工作,我们可以少在哪个方面工作。

我们今天是防御素的沙龙,也涵盖了小球藻的使用,刚才王局长提了非常重要的一点,你要找一个急病,比如说现在小学、幼儿园大量的一阵一阵的发生口腔里面的病(手足口),而且反复的发作,特痛苦,也没什么药,回来就是休息、喝水,到医院检查完了医院告诉你好了才能上学。这些东西确实有用,就在这方面做一个必要开发,如果光提广谱,一提广谱人家觉得就是红药水什么都管用。瞄准一个开发一个,然后再找第二个。咱们国家药品批下来也是相当难的,你要做好几年的战斗准备。我听说美国一个新药10亿美元10年,中国是不是可以快一点,但是也需要投入大量的经费,所以咱们书记也在这,将来在这方面也跟所长研究研究,能够对他们组看中一个项目给予一定资助,打响一炮。真的到一期临床的时候,就不是遗传发育所负担得起的,就要找合作单位了。

孙勇如:那个是时候需要跟企业合作。

安锡培:我们时间正好,刚才世民算做了一个小结,我们现在看来它的潜力很大,也需要进一步完善,需要克服。

王贵海:我个人感觉今天的沙龙开的还是不错的,从选题上作为具有免疫功能的重要分子,具有重要的理论研究和应用意义。作为免疫系统,分子作用机制很多还是不清楚的,在基础研究、前沿研究当中有重要的研究价值的。我建议能不能在基础研究当中深入做点东西,可以和别所分子免疫团队合作。这是一个方面。

第二个建议,所里的老同志一直坚持在应用方向开发有价值应用前景的东西,承担院里“十二五”项目,承担国家项目,重点项目,也得到了支持。希望能够集中方向,在原有比较好的基础上有所突破。瞄准几个方向。第一个比较重要就是在饲料添加剂方面,现在可以在企业方面运作,或者我们自己成立一个企业来推动这个成果。因为很多标准已经拿到了。但是你要作为一个饲料添加剂还有许多研究去做。如果做好了,打到国内市场、国外市场都可以的。

鸡的抗病性对养鸡产业来讲很重要的。如果能在普通的流行性疾病上能够起作用,如果搞一点研究能抗禽流感那就更好了。就是说,一定要选择国家需求大的东西,做一些基础性的工作。我觉得最近一条路做成饲料添加剂的高端产业是可以的。

在人类疾病研究来讲,要选准方向,它对很多病都有作用,特别是作为免疫性分子对黏膜性疾病有作用明显。但是选择疾病最好是选择现在还没有好药来治的病,根据防御素作为成药研究的特点,怎么做最容易做,比如做外用药,涂抹,包括皮肤、抗菌,弄好了跟创可贴弄在一起就很好,化妆品也可以。这些根据防御素本身多肽的特点,在成药研究少走路,给老百姓解决大问题。所以在适应症选择问题上要好好想想,希望我们团队继续努力作出突破性工作。

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